本發(fā)明涉及細胞的培養(yǎng)，尤其涉及一種nk細胞的培養(yǎng)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、自然殺傷(nk)細胞作為癌癥免疫療法的藥物方式是有效的，因為nk細胞可以殺死各種腫瘤細胞，而無需故意免疫、激活或事先致敏。與t細胞不同，nk細胞缺乏表面t細胞受體(tcr)，不會引起移植物抗宿主病(gvhd)，因此nk細胞具有同種異體療法的優(yōu)勢。

2、對于nk細胞在臨床上的同種異體療法應(yīng)用的關(guān)鍵是其純度和數(shù)量，研究表明，nk細胞的激活和增殖有多種途徑，包括細胞因子刺激、受體激活劑刺激和飼養(yǎng)細胞刺激，其中細胞因子刺激和受體激活劑刺激前期需要一定比例的其他淋巴細胞(如t淋巴細胞、單核細胞等)，往往因為個體差異導(dǎo)致其他淋巴細胞的比例不好把控和最終的nk純度參差不齊，而飼養(yǎng)細胞刺激會引發(fā)異樣細胞的殘留，給成品的質(zhì)控帶來一定挑戰(zhàn)。使用提純后nk細胞作為增殖起點能有效解決nk細胞培養(yǎng)純度低的問題，但是提純后nk細胞在一般培養(yǎng)條件下的增殖較為緩慢且增殖代次有限。

3、另有研究表明，中藥多糖可以直接促進免疫器官和免疫細胞的生長，并通過與免疫細胞表面的受體結(jié)合，激活多種信號通路，調(diào)節(jié)機體促炎因子、抗炎因子和趨化因子水平，進而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，維持免疫細胞的活性。以及腫瘤細胞能激活nk增殖的原理是腫瘤細胞表達的某些蛋白或信號分子直接作用于nk細胞表面受體，引發(fā)nk細胞的免疫反應(yīng)。

4、因此，探索提純后nk細胞高純度、高數(shù)量、穩(wěn)定安全的培養(yǎng)工藝是目前同種異體nk應(yīng)用所面臨的挑戰(zhàn)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、根據(jù)上述提出的技術(shù)問題，而提供一種nk細胞的培養(yǎng)方法及應(yīng)用。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)手段如下：

3、一種nk細胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

4、(1)準備100ml外周血或臍帶血樣本，使用ficoll分離液從血液樣本中提取pbmc；

5、(2)利用nk細胞分選試劑盒，通過磁珠陰選技術(shù)從pbmc中分離出流式細胞術(shù)檢測純度≥95％的cd3-cd56+nk細胞；

6、(3)將分離得到的cd3-cd56+nk細胞接種于nk擴增培養(yǎng)基中，進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為24天。

7、優(yōu)選的，所述nk擴增培養(yǎng)基的制備方法，包括以下組分：

8、(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選自dmem/f12或imdm；

9、(2)添加至培養(yǎng)基中的中藥多糖總量為50～200ug/ml，包括但不限于靈芝多糖、銀杏多糖、白及多糖、東方栓菌多糖中的一種或多種；

10、(3)添加1000u/ml的il-2以促進細胞增殖；

11、(4)添加1％血小板裂解物以提供細胞生長因子。

12、優(yōu)選的，所述體外培養(yǎng)的過程管理包括以下步驟：

13、(1)每隔2～3天對培養(yǎng)中的nk細胞進行補液操作，確保細胞密度維持在2*106cells/ml；

14、(2)在第0、9、16天分別向培養(yǎng)基中添加5～10μg/ml的人肺間皮瘤細胞提取物；

15、(3)在第21天向培養(yǎng)基中添加200μg/ml的百里香醌(thymoquinone)以增強細胞功能。

16、優(yōu)選的，所述人肺間皮瘤細胞提取物的制備方法，具體包括以下步驟：

17、(1)取h2052人肺間皮瘤細胞系，在含有10％?fbs和30～60μm干擾素基因刺激因子(sting)的rpmi-1640培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)；

18、(2)接種細胞密度為100萬/ml，每隔2～3天補液，細胞密度維持在100萬/ml，擴增細胞數(shù)量至50～1000倍后，離心收集細胞和培養(yǎng)液；

19、(3)用pbs洗滌細胞沉淀兩次，離心棄上清，得到純凈的細胞沉淀；

20、(4)使用含有1x蛋白酶抑制劑和1x磷酸酶抑制劑的ripa裂解和提取緩沖液，在冰浴條件下對細胞沉淀進行破碎提取。

21、優(yōu)選的，所述人肺間皮瘤細胞破碎提取的具體操作，包括以下步驟：

22、(1)用提取緩沖液重懸細胞沉淀至1000萬/ml的濃度，每管不超過10ml；

23、(2)在冰浴條件下靜置10分鐘后輕輕搖晃均勻，重復(fù)該操作兩次，總共處理30分鐘；

24、(3)將處理后的液體分裝至1.5ml?ep管中，在4℃下12000g離心20分鐘，取上清轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，進行離心和洗滌；

25、(4)使用bca法檢測蛋白濃度，并用pbs將提取物定容至1mg/ml備用。

26、優(yōu)選的，培養(yǎng)環(huán)境的控制，具體為：

27、(1)將nk細胞置于溫度為37℃、環(huán)境氣氛為5％?co2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；

28、(2)確保在整個培養(yǎng)過程中，環(huán)境條件保持穩(wěn)定，無污染。

29、本發(fā)明還提供了一種采用上述nk細胞的培養(yǎng)方法收集的nk細胞在實體腫瘤細胞殺傷中的應(yīng)用。

30、較現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

31、1、提純后nk細胞增殖時間長，增殖倍數(shù)高，可持續(xù)培養(yǎng)至30天；

32、2、中藥多糖能促進nk細胞的增殖效率和細胞活性，促進細胞因子的分泌；

33、3、高濃度的百里香醌72h內(nèi)能有效抑制t細胞增殖和活性，但對nk細胞無毒性，能進一步維持nk培養(yǎng)的純度；

34、4、使用sting刺激培養(yǎng)的人肺間皮瘤細胞提取物相具有很強的nk細胞腫瘤殺傷活性和促進能力，尤其在于殺傷實體瘤細胞的表現(xiàn)，同時也有很強的促nk細胞增殖能力。

35、基于上述理由本發(fā)明可在細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域廣泛推廣。

技術(shù)特征：

1.一種nk細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的nk細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述nk擴增培養(yǎng)基的制備方法，包括以下組分：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的nk細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述體外培養(yǎng)的過程管理包括以下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的nk細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述人肺間皮瘤細胞提取物的制備方法，具體包括以下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的nk細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述人肺間皮瘤細胞破碎提取的具體操作，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的nk細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，培養(yǎng)環(huán)境的控制，具體為：

7.一種采用權(quán)利要求1-6任意一項權(quán)利要求所述的nk細胞的培養(yǎng)方法收集的nk細胞在實體腫瘤細胞殺傷中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，公開了NK細胞的培養(yǎng)方法及應(yīng)用，包括準備外周血或臍帶血樣本，使用Ficoll分離液從血液樣本中提取PBMC；利用NK細胞分選試劑盒，從PBMC中分離出流式細胞術(shù)檢測純度≥95％的CD3?CD56+NK細胞；將得到的CD3?CD56+NK細胞接種于NK擴增培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，周期為24天，擴增培養(yǎng)基中添加一種或多種中醫(yī)多糖、IL?2和血小板裂解物，并在細胞培養(yǎng)第21天添加百里香醌。本發(fā)明提純后NK細胞增殖時間長，增殖倍數(shù)高，可持續(xù)培養(yǎng)至30天；中藥多糖促進NK細胞的增殖效率和細胞活性及細胞因子的分泌；百里香醌72h內(nèi)能有效抑制T細胞增殖和活性，能進一步維持NK培養(yǎng)的純度。

技術(shù)研發(fā)人員：劉長斌,湯曉倩,張宗申,薛永常
受保護的技術(shù)使用者：大連工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10