本申請(qǐng)涉及綠針假單胞菌，具體涉及綠針假單胞菌的工程菌株、制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、綠針假單胞菌(pseudomonas?chlororaphis)是目前研究較多的生防菌種之一。目前該菌種已報(bào)道有四個(gè)亞種，均可產(chǎn)生有顏色的吩嗪類化合物抗生素。該種的菌株多分離自植物根際，對(duì)植物抵抗病原菌、線蟲等的侵染起到保護(hù)作用。綠針假單胞菌作為根際共生細(xì)菌，其能影響植物生長，并在控制植物病害和提高作物產(chǎn)量等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，因而對(duì)于該菌株的研究也逐步深入。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本申請(qǐng)對(duì)綠針假單胞菌進(jìn)行基因工程改造得到一種工程菌株。該工程菌株能夠高效表達(dá)殺滅多種害蟲(例如柳藍(lán)葉甲、茄二十八星瓢蟲)的dsrna。同時(shí)，該綠針假單胞菌本身具有殺蟲活性，結(jié)合其表達(dá)dsrna所引發(fā)的rnai，該工程菌株具有顯著的殺蟲能力。另外，該工程菌株為非人體、非野生動(dòng)物及非環(huán)境病原菌，具有安全性，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)及林業(yè)領(lǐng)域。

2、為此，本申請(qǐng)實(shí)施例至少公共了以下技術(shù)方案：

3、第一方面，實(shí)施例提供了一種工程菌株。該工程菌株為rnase?iii基因被敲除、具有插入于glms基因下游第19個(gè)核苷酸處插入t7操縱子、表達(dá)干擾actin基因的dsrna及表達(dá)干擾srp54k基因的dsrna中至少一項(xiàng)的綠針假單胞菌。所述綠針假單胞菌為p.chlororaphis?pcr3-3(2)，保藏編號(hào)為cctcc?no:m20241949，保藏日期為2024年09月09日。所述rnase?iii基因位于p.chlororaphis?pcr3-3(2)基因組(genbank:cp128834.1)的5741469-5743301nt區(qū)域。所述glms基因位于p.chlororaphis?pcr3-3(2)基因組的(genbank:cp128834.1)的4534388-4535077nt區(qū)域。

4、第二方面，實(shí)施例公開了一種工程菌株。該工程菌株為rnase?iii基因被敲除的綠針假單胞菌pcr3-3(2)。

5、第三方面，實(shí)施例公開了一種工程菌株。該工程菌株為rnase?iii基因被敲除及具有插入于glms基因下游第19個(gè)核苷酸處的t7操縱子的綠針假單胞菌pcr3-3(2)。

6、第四方面，實(shí)施例公開了一種工程菌株。該工程菌株為rnase?iii基因被敲除、具有插入于glms基因下游第19個(gè)核苷酸處插入t7操縱子及表達(dá)干擾actin基因的dsrna的綠針假單胞菌pcr3-3(2)。

7、第五方面，實(shí)施例公開了一種工程菌株。該工程菌株為rnase?iii基因被敲除、具有插入于glms基因下游第19個(gè)核苷酸處插入t7操縱子及表達(dá)干擾gfp基因的dsrna的綠針假單胞菌pcr3-3(2)。

8、第六方面，實(shí)施例公開了一種工程菌株。該工程菌株為rnase?iii基因被敲除、具有插入于glms基因下游第19個(gè)核苷酸處插入t7操縱子及表達(dá)干擾srp54k基因的dsrna的綠針假單胞菌pcr3-3(2)。

9、第七方面，實(shí)施例公開了一種工程菌株的制備方法。該制備方法包括得到用于敲除rnase?iii基因的第一質(zhì)粒及用于插入t7操縱子的第二質(zhì)粒；將第一質(zhì)粒及第二質(zhì)粒中的至少一項(xiàng)分別轉(zhuǎn)入至綠針假單胞菌pcr3-3(2)。

10、第八方面，實(shí)施例公開了第一至六任一方面所述的工程菌株或第七方面所述的制備方法制得的工程菌株在制備防治柳藍(lán)葉甲和茄二十八星瓢蟲的制劑或殺蟲劑中的應(yīng)用。

技術(shù)特征：

1.一種工程菌株，所述工程菌株為rnase?iii基因被敲除、具有插入于glms基因下游第19個(gè)核苷酸處插入t7操縱子、表達(dá)干擾actin基因的dsrna及表達(dá)干擾srp54k基因的dsrna中至少一項(xiàng)的綠針假單胞菌(p.chlororaphis)pcr3-3(2)；

2.一種工程菌株，該工程菌株為rnase?iii基因被敲除的綠針假單胞菌(p.chlororaphis)pcr3-3(2)；

3.一種工程菌株，該工程菌株為rnase?iii基因被敲除及具有插入于glms基因下游第19個(gè)核苷酸處的t7操縱子的綠針假單胞菌(p.chlororaphis)pcr3-3(2)；

4.一種工程菌株，該工程菌株為rnase?iii基因被敲除、具有插入于glms基因下游第19個(gè)核苷酸處的t7操縱子及表達(dá)干擾actin基因的dsrna的綠針假單胞菌(p.chlororaphis)pcr3-3(2)；

5.一種工程菌株，該工程菌株為rnase?iii基因被敲除、具有插入于glms基因下游第19個(gè)核苷酸處的t7操縱子及表達(dá)干擾gfp基因的dsrna的綠針假單胞菌(p.chlororaphis)pcr3-3(2)；

6.一種工程菌株，該工程菌株為rnase?iii基因被敲除、具有插入于glms基因下游第19個(gè)核苷酸處的t7操縱子及表達(dá)干擾srp54k基因的dsrna的綠針假單胞菌(p.chlororaphis)pcr3-3(2)；

7.一種工程菌株的制備方法，包括：

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，所述第一質(zhì)粒為攜帶有rnase?iii上游同源序列、卡那霉素抗性基因和rnase?iii下游同源序列順序連接序列的pk18mobsacb質(zhì)粒，所述rnase?iii上游同源序列如seq?id?no:1所示，所述rnase?iii下游同源序列如seq?id?no:2所示，所述第二質(zhì)粒為攜帶t7操縱子的puc18t-mini-tn7t-gm質(zhì)粒，所述t7操縱子如seq?idno:7所示。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，還包括得到表達(dá)actin基因或srp54k基因的干擾dsrna的第三質(zhì)粒，以及將所述第三質(zhì)粒轉(zhuǎn)入經(jīng)所述第一質(zhì)粒和/或所述第二質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所得工程菌株中的步驟。

10.權(quán)利要求1～6任一所述的工程菌株或如權(quán)利要求7～9任一所述的制備方法制得的工程菌株在制備防治柳藍(lán)葉甲和茄二十八星瓢蟲的制劑或殺蟲劑中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)公開了綠針假單胞菌的工程菌株、制備方法及應(yīng)用。該工程菌株包括RNase?III基因被敲除和/或具有插入于glmS基因下游第19個(gè)核苷酸處的T7操縱子的綠針假單胞菌。該工程菌株能夠高效表達(dá)殺滅多種害蟲的dsRNA。該工程菌株為非人體、非野生動(dòng)物及非環(huán)境病原菌，具有安全性，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)及林業(yè)領(lǐng)域。

技術(shù)研發(fā)人員：楊升,謝蒙蒙,張江,周聶新,張桂銘,張鳳娟
受保護(hù)的技術(shù)使用者：湖北大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10