本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，更具體地，本發(fā)明涉及一種體內(nèi)產(chǎn)生人源car-t細胞的t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、嵌合抗原受體(chimericantigen?receptor，car)t細胞療法是一種針對腫瘤的精準(zhǔn)靶向療法，目前已經(jīng)取得了令人矚目的臨床療效。其中，嵌合抗原受體由人工構(gòu)建而成，主要由三個結(jié)構(gòu)域組成：胞外區(qū)靶向結(jié)合域、跨膜區(qū)以及一個或多個胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。近年來，car-t細胞療法相關(guān)的臨床試驗數(shù)量迅速增長。自2017年美國食品藥品監(jiān)督管理局(fda)批準(zhǔn)首個car-t細胞藥物以來，全球已有十五款car-t細胞藥物獲批上市，其中兩款在中國。

2、迄今為止，已上市的car-t細胞療法藥物都需要在體外制備t細胞，其步驟包括從患者體內(nèi)分離t細胞，通過病毒載體將car基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至t細胞中，然后激活并擴增這些t細胞，最終回輸至患者體內(nèi)。car-t細胞療法是高度個性化的治療方法，每個病人就是單獨的批次，無法實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，且對操作人員及生產(chǎn)環(huán)境要求嚴(yán)格，加之其制備過程耗時較長，因此可能會延誤腫瘤患者的病情，限制car-t細胞療法的應(yīng)用。并且，car-t細胞療法的副作用也不容忽視，尤其是細胞因子釋放綜合癥(cytokine?release?syndrome，crs)，其臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱、心動過速、缺氧及其他器官功能障礙，嚴(yán)重時可致命。為了緩解crs，臨床上只能使用皮質(zhì)類固醇激素短暫抑制體內(nèi)的部分炎癥反應(yīng)，無法從根源上消除炎癥。此外，在臨床car-t細胞療法中，還存在著病毒載體插入到宿主細胞基因組的風(fēng)險，導(dǎo)致插入突變、激活原癌基因、異位基因表達等基因毒性問題。

3、為了解決car-t細胞制備流程繁雜的問題，已經(jīng)有研究人員開始嘗試在體內(nèi)制備car-t細胞。waqas?nawaz等人使用腺相關(guān)病毒遞送靶向cd4的car基因，能夠產(chǎn)生具有靶向殺傷活性的car-t細胞，對t細胞淋巴瘤有顯著性的治療效果。然而，該制備方法仍然會在體內(nèi)產(chǎn)生持續(xù)激活car-t細胞，進而導(dǎo)致細胞因子風(fēng)暴等副作用。一些研究通過將carmrna瞬時轉(zhuǎn)染進t細胞，以制備短期存在、表達量可控的car-t細胞。m.t.stephan課題組的研究人員使用脂質(zhì)納米顆粒如lnp(lipidnanoparticles)等包載car?mrna，使用瞬時轉(zhuǎn)染方式在體內(nèi)短期生成car-t細胞，期望實現(xiàn)更安全的治療效果。lnp在生理環(huán)境中能夠有效保護mrna，并可以通過內(nèi)吞作用進入細胞、借助可電離脂質(zhì)在酸化環(huán)境下破壞內(nèi)涵體，從而將mrna遞送至細胞質(zhì)。但系統(tǒng)性給藥的lnp主要在肝臟富集，難以靶向其他組織細胞，且lnp主要依賴被動攝取機制進入細胞，在胞內(nèi)常被困于內(nèi)涵體中、可成功實現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸的比例低，最終導(dǎo)致大部分mrna被降解，無法釋放到細胞質(zhì)中發(fā)揮功效。

4、艾滋病毒(hiv)通過“主動識別觸發(fā)膜融合”機制將其基因組rna高效傳遞至t細胞的細胞質(zhì)中。hiv利用包膜上的人膜融合蛋白gp160的gp120亞基識別t細胞的cd4分子，通過gp41亞基在細胞膜上產(chǎn)生融合孔，使病毒包膜與t細胞膜相互融合，從而將基因組rna直接傳遞到細胞質(zhì)中進行高效感染。這一機制提供了一種設(shè)計高效mrna藥物遞送載體的思路。

5、研究表明，模擬rna病毒構(gòu)建的仿病毒顆粒能用于遞送mrna藥物。例如，一些研究利用內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的衣殼蛋白peg10或gag-ms2等包載mrna，并通過膜融合蛋白vsv-g誘導(dǎo)內(nèi)涵體膜融合，將mrna遞送到細胞質(zhì)中。然而，現(xiàn)有的仿病毒顆粒缺乏“主動識別觸發(fā)膜融合”能力，導(dǎo)致細胞特異性和遞送效率不足，難以靶向遞送mrna至t細胞。

6、因此，目前仍有待開發(fā)能夠直接將mrna藥物精確、高效遞送至t細胞，在體內(nèi)產(chǎn)生人源car-t細胞的仿病毒顆粒。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于此，本發(fā)明的目的在于提供了一種t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明的仿病毒顆粒能夠直接將car?mrna藥物精確、高效遞送至t細胞，在體內(nèi)有效且快速地制備瞬時人源car-t細胞。

2、實現(xiàn)上述發(fā)明目的的具體技術(shù)方案包括如下。

3、本發(fā)明的第一方面，公開了一種t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒，其是將人t細胞特異性膜融合蛋白的表達質(zhì)粒、mrna裝載蛋白的表達質(zhì)粒和car?mrna的表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入293t細胞制備而得；所述人t細胞特異性膜融合蛋白的表達質(zhì)粒與所述mrna裝載蛋白的表達質(zhì)粒的摩爾比為1：1.8～2.2；所述mrna裝載蛋白的表達質(zhì)粒和car?mrna的表達質(zhì)粒的摩爾比為1：2～4。

4、本發(fā)明的第二方面，公開了上述t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒的制備方法，包括以下步驟：

5、(1)、構(gòu)建人t細胞特異性膜融合蛋白的表達質(zhì)粒、mrna裝載蛋白的表達質(zhì)粒和utr-anti-human?cd19?car的表達質(zhì)粒；

6、(2)、將步驟(1)構(gòu)建的三個表達質(zhì)粒共同瞬時轉(zhuǎn)染入293t細胞孵育45h～55h后，超速離心，純化，即得。

7、本發(fā)明的第三方面，公開了上述t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

8、本發(fā)明的t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒，通過將人t細胞特異性膜融合蛋白的表達質(zhì)粒、mrna裝載蛋白的表達質(zhì)粒和car?mrna的表達質(zhì)粒，按照一定的摩爾比，共同瞬時轉(zhuǎn)染入293t細胞，利用病毒出芽機制制備而得，其能借助人t細胞特異性膜融合蛋白與t細胞膜高效融合，從而能將裝載的car?mrna藥物特異性遞送到t細胞的胞質(zhì)當(dāng)中(繞過了內(nèi)涵體的途徑，減少了遞送mrna藥物時的藥物遞送效率低和肝毒性問題，有效提高car?mrna作用于t細胞的穩(wěn)定性和靶向性)制備car-t細胞，且car-t細胞是瞬時產(chǎn)生的，不會持續(xù)激活car-t細胞(能夠在實現(xiàn)快速高效誘導(dǎo)car蛋白表達的同時避免基因組整合并提供快速反應(yīng)、提高治療的安全性和可控性)，本發(fā)明制備的t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒可通過靜脈注射的方式在體內(nèi)(也可體外)特異性地將car?mrna藥物(如anti-human?cd19?carmrna等)遞送至t細胞，實現(xiàn)在t細胞中特異性表達car蛋白，使t細胞在體內(nèi)原位被改造成car-t細胞，大大簡化了car-t細胞產(chǎn)品的制備流程，縮短了治療周期，并且能夠精確靶向并殺死腫瘤細胞，顯著增強t細胞活性和抗腫瘤效應(yīng)，且有望減少體內(nèi)治療中細胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生，提高安全性。

技術(shù)特征：

1.一種t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒，其特征在于，其是將人t細胞特異性膜融合蛋白的表達質(zhì)粒、mrna裝載蛋白的表達質(zhì)粒和car?mrna的表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入293t細胞制備而得；所述人t細胞特異性膜融合蛋白的表達質(zhì)粒與所述mrna裝載蛋白的表達質(zhì)粒的摩爾比為1：1.8～2.2；所述mrna裝載蛋白的表達質(zhì)粒和car?mrna的表達質(zhì)粒的摩爾比為1：2～4。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒，其特征在于，所述mrna裝載蛋白的表達質(zhì)粒和car?mrna的表達質(zhì)粒的摩爾比為1：3～4，更優(yōu)選為1：3。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒，其特征在于，所述人t細胞特異性膜融合蛋白是通過將hiv病毒的gp160、麻疹病毒的mv-h/mv-f或水泡性口炎病毒的vsv-g靶向亞基的基因序列中引入突變?nèi)コ械氖荏w識別能力，再將anti-cd3scfv、anti-cd4?scfv或anti-cd8?scfv連接在相應(yīng)靶向亞基的胞外端而獲得的。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒，其特征在于，所述人t細胞特異性膜融合蛋白是將序列如seq?id?no:2所示的anti-cd3?scfv連接在序列如seq?idno:1所示的突變的gp160基因的胞外端而獲得的。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒，其特征在于，所述mrna裝載蛋白包括mrna裝載蛋白peg10和mrna裝載蛋白gag-ms2或mrna裝載蛋白gag-tat。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒，其特征在于，所述蛋白peg10的核苷酸序列如seq?id?no:3所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒，其特征在于，所述carmrna具有特定utr信號并荷載靶向人腫瘤細胞靶點anti-cd19或anti-egfrviii。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒，其特征在于，所述carmrna為具有特定utr信號并荷載靶向人腫瘤細胞靶點anti-cd19，其序列如seq?id?no:4所示。

9.權(quán)利要求1～8任一項所述的t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

10.權(quán)利要求1～8任一項所述的t細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種T細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒及其制備方法和應(yīng)用，其是將人T細胞特異性膜融合蛋白的表達質(zhì)粒、mRNA裝載蛋白的表達質(zhì)粒和CAR?mRNA的表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入293T細胞制備而得；所述mRNA裝載蛋白的表達質(zhì)粒和CAR?mRNA的表達質(zhì)粒的摩爾比為1：2～4。本發(fā)明利用病毒出芽機制生產(chǎn)T細胞特異性膜融合型仿病毒顆粒，能將裝載的CAR?mRNA藥物特異性遞送到T細胞的胞質(zhì)當(dāng)中，瞬時產(chǎn)生CAR?T細胞，大大簡化了CAR?T細胞產(chǎn)品的制備流程，縮短了治療周期，并且能夠精確靶向并殺死腫瘤細胞，顯著增強T細胞活性和抗腫瘤效應(yīng)，且有望減少體內(nèi)治療中細胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生，提高安全性。

技術(shù)研發(fā)人員：許從飛,王悅,楊敏,張寶月,魯紫東,王均
受保護的技術(shù)使用者：華南理工大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10