本發(fā)明屬于昆蟲生物防治，具體涉及一種可高效殺滅草地貪夜蛾的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、草地貪夜蛾spodopterafrugiperda(j.e.smith)又叫“秋粘蟲”(fallarmyworm)，屬鱗翅目lepidoptera夜蛾科noctuidae，具有寄主范圍廣、繁殖能力高、遷移能力強、產(chǎn)生抗藥性快、適生區(qū)域廣、突發(fā)危害嚴(yán)重等特點。草地貪夜蛾原產(chǎn)于美洲的亞熱帶和熱帶地區(qū)，2018年末，草地貪夜蛾從緬甸入侵我國云南，截止到2022年9月，草地貪夜蛾累計在我國27個省份846個縣發(fā)生3,531萬畝(https://www.natesc.org.cn)，給我國的糧食安全帶來了巨大威脅。

2、草地貪夜蛾寄主范圍廣，可以取食超過353種植物，喜食玉米。一個世代約30d(28℃)，較冷的月份則可延長至60-90d，卵期3-4d，幼蟲有6個齡期，低齡幼蟲聚集危害，高齡后分散，4齡后進(jìn)入暴食期，顯現(xiàn)自殘習(xí)性。老熟幼蟲入土化蛹，蛹期7-37d。成蟲平均壽命10d左右，需補充營養(yǎng)后生殖器官才能發(fā)育成熟。草地貪夜蛾危害玉米后，玉米的產(chǎn)量損失為15％至73％。

3、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(autographa?california?multiplenuclearpolyhedrosis?virus，acmnpv)是桿狀病毒屬的模式病毒，已被廣泛應(yīng)用于重組蛋白表達(dá)和害蟲生物防治。acmnpv可以侵染鱗翅目的50多個物種，以acmnpv為基礎(chǔ)的殺蟲劑已在多個國家被開發(fā)為商業(yè)產(chǎn)品。acmnpv感染鱗翅目幼蟲的作用位點在中腸，其多角體被鱗翅目幼蟲口服后，在中腸發(fā)生作用，穿過圍食膜和基底膜兩層屏障后，進(jìn)入昆蟲體液。因此，acmnpv具有作為微生物殺蟲劑防治草地貪夜蛾的潛力，但是acmnpv存在殺蟲速度慢、對宿主感染力低等問題。

4、蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis，bt)是一種革蘭氏陽性(g+)細(xì)菌，屬于芽孢桿菌科、蠟樣芽孢桿菌屬，是一種天然存在的昆蟲病原細(xì)菌。作為一種對生態(tài)安全性較高的微生物農(nóng)藥，bt已在世界上被廣泛使用。bt之所以可以作為生物殺蟲劑防治農(nóng)林業(yè)害蟲，是因為其能形成特異性毒殺害蟲的殺蟲蛋白，包括殺蟲晶體蛋白(insecticidalcrystal?proteins,icps)、營養(yǎng)期殺蟲蛋白(vegetativeinsecticidalprotein,vip)等。icps在有害昆蟲生物防治方面發(fā)揮了重要作用，但由于其長時間大面積使用，許多昆蟲對其產(chǎn)生了較強的抗性，vip蛋白通常不以晶體形式存在，但是與cry蛋白相比，vip蛋白具有廣泛的殺蟲譜。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了發(fā)揮acmnpv和vip在殺滅草地貪夜蛾方面的優(yōu)勢，本發(fā)明公開了一種可高效殺滅草地貪夜蛾的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac及其應(yīng)用。經(jīng)實驗證明，表達(dá)vip3a基因后acmnpv對草地貪夜蛾幼蟲的毒力明顯提升，且將vip3a基因表達(dá)在病毒表面，進(jìn)一步提高了病毒對草地貪夜蛾幼蟲的殺滅作用。重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac對草地貪夜蛾具有顯著的防治效果，在草地貪夜蛾的生物防治中具有良好的應(yīng)用前景。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種可高效殺滅草地貪夜蛾的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac，所述重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac已于2024年8月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.46096，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，分類命名為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(autographa?california?multiplenuclearpolyhedrosisvirus)；

4、所述重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac的基因組中含有ph基因、svt基因，所述ph基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述svt融合基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

5、所述svt基因為在vip3a基因序列n端插入桿狀病毒囊膜糖蛋白gp64的信號肽sp序列與在c端插入結(jié)構(gòu)域tmd序列融合而成，所述vip3a基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

6、一種制備上述的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac的方法，包括以下步驟：

7、1)將ph基因克隆至pfastbac?dual載體，獲得轉(zhuǎn)移載體pfastbac-dual-ph；所述ph基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；

8、2)將svt基因克隆至轉(zhuǎn)移載體pfastbac-dual-ph，獲得轉(zhuǎn)移載體pfastbac-dual-ph-svt；所述svt基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

9、3)將轉(zhuǎn)移載體pfastbac-dual-ph-svt轉(zhuǎn)化dh10bac，獲得重組bacmid質(zhì)粒；

10、4)將重組bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，獲得表面表達(dá)vip3a蛋白的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac。

11、上述的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac在防治草地貪夜蛾中的應(yīng)用；

12、所述應(yīng)用為：將重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac飼喂草地貪夜蛾。

13、上述的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac在制備防治草地貪夜蛾制劑中的應(yīng)用。

14、一種防治草地貪夜蛾的制劑，所述制劑包括上述的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac。

15、一種增強苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對草地貪夜蛾毒力的方法，所述方法為：將vip3a基因重組到苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒基因組中，從而提高苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對草地貪夜蛾的毒力；所述vip3a基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

16、優(yōu)選的，所述方法為：將vip3a蛋白表達(dá)于苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒表面；所述vip3a蛋白由vip3a基因所編碼，所述vip3a基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

17、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

18、本發(fā)明利用acmnpv和vip在殺滅草地貪夜蛾方面的優(yōu)勢，將vip表達(dá)在acmnpv表面，成功獲得了可高效殺滅草地貪夜蛾的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac，重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac對草地貪夜蛾的半致死濃度lc50為1.065×106pib/ml。

技術(shù)特征：

1.一種可高效殺滅草地貪夜蛾的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac，其特征在于：所述重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac已于2024年8月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.46096，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，分類命名為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（autographa?california?multiplenuclearpolyhedrosis?virus）。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac，其特征在于：所述重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac的基因組中含有ph基因、svt基因，所述ph基因的核苷酸序列如seq?idno.2所示，所述svt基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac，其特征在于：所述svt基因在vip3a基因序列的n端插入桿狀病毒囊膜糖蛋白gp64的信號肽sp序列與在c端插入跨膜結(jié)構(gòu)域tmd序列融合而成，所述vip3a基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4.一種制備權(quán)利要求1~3任一項所述的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac的方法，其特征在于：包括以下步驟：

5.如權(quán)利要求1~3任一項所述的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac在防治草地貪夜蛾中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：將重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac飼喂草地貪夜蛾。

7.如權(quán)利要求1~3任一項所述的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac在制備防治草地貪夜蛾制劑中的應(yīng)用。

8.一種防治草地貪夜蛾的制劑，其特征在于：所述制劑包括權(quán)利要求1~3任一項所述的重組昆蟲桿狀病毒ph-svt/ac。

9.一種增強苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對草地貪夜蛾毒力的方法，其特征在于：將vip3a基因重組到苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒基因組中，從而提高苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對草地貪夜蛾的毒力；所述vip3a基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：將vip3a蛋白表達(dá)于苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒表面；所述vip3a蛋白由vip3a基因所編碼，所述vip3a基因的核苷酸序列如seq?idno.1所示。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于昆蟲生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可高效殺滅草地貪夜蛾的重組昆蟲桿狀病毒PH?SVT/AC及其應(yīng)用。所述重組昆蟲桿狀病毒PH?SVT/AC已于2024年8月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.46096，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，分類命名為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa?california?multiplenuclear?polyhedrosis?virus）。所述重組昆蟲桿狀病毒PH?SVT/AC對草地貪夜蛾具有顯著的防治效果，在草地貪夜蛾的生物防治中具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：王竹紅,葛均青,徐騰,董志剛,馬小龍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：福建農(nóng)林大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10