本發(fā)明涉及基因，更具體地，本發(fā)明涉及煙草cbl家族基因ntcbl3a在提高煙葉鉀含量中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、鉀(k+)是植物中最重要的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，參與了細(xì)胞中蛋白合成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和滲透調(diào)節(jié)等生理功能。煙草(nicotiana?tabacum)作為一種高度依賴鉀素的經(jīng)濟(jì)作物，煙葉是最主要的應(yīng)用器官，煙草中鉀素含量直接影響煙草煙葉的外觀質(zhì)量、化學(xué)成分以及燃燒性等多種品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。提高煙草中的鉀含量，能夠使煙葉呈深桔黃色，葉片長(zhǎng)寬、富有彈性和韌性并具有光澤，提升煙草品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而目前，不僅面臨鉀肥產(chǎn)量短缺的問(wèn)題，還面臨著土壤中速效鉀素的流失、土壤鉀素含量不均衡等問(wèn)題。如安順煙區(qū)半數(shù)地區(qū)土壤中的速效鉀含量低于150mg/kg的平均值，整體屬于缺鉀狀態(tài)；吉安永豐縣煙區(qū)土壤速效鉀均值為123.90mg/kg，27.78％的土壤樣品的速效鉀處于極缺水平。然而，通過(guò)施用鉀肥等措施提高煙葉鉀含量，效果有限且可能導(dǎo)致土壤板結(jié)等副作用。因此，利用基因工程培育富含鉀素的優(yōu)質(zhì)新品種，這對(duì)煙草品種改良工作具有一定的意義。

2、鈣離子(ca2+)作為重要的次級(jí)信號(hào)分子參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境信號(hào)的應(yīng)答。其中，類鈣調(diào)磷酸酶b亞基蛋白(calcineurinb-like?protein，cbl)家族是植物中特異存在的鈣離子感受器家族。該家族成員cbl2和cbl3會(huì)與下游互作蛋白激酶cipk(cbl-interactingproteinkinase)中的cipk3/9/23/26形成復(fù)合體，參與了液泡中k+的釋放并調(diào)控植物中k+的動(dòng)態(tài)平衡。

3、本發(fā)明從普通煙草中克隆到一個(gè)來(lái)源于父本祖先種林煙草中的cbl家族基因ntcbl3a，并利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建煙草ntcbl3a敲除材料。通過(guò)功能分析，明確敲除ntcbl3a可提高煙葉鉀含量，鑒定負(fù)調(diào)控?zé)煵葩浐刻岣叩南嚓P(guān)基因ntcbl3a并加以應(yīng)用，在提高煙葉鉀含量中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提出一個(gè)煙草cbl家族基因ntcbl3a在煙草中的新應(yīng)用，通過(guò)鑒定獲得了該煙草cbl家族基因ntcbl3a具有促進(jìn)煙草煙葉鉀素積累的新功能，拓展了該基因在煙草鉀素積累效率改良中的新用途。

2、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

3、本發(fā)明提供一種煙草cbl家族基因ntcbl在提升煙草鉀含量中的應(yīng)用，所述基因的核苷酸序列包含如下(1)～(4)中的任一項(xiàng)：

4、(1)如seq?id?no.1所示的核苷酸序列；或，

5、(2)與seq?id?no.1所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或，

6、(3)在seq?id?no.1所示的核苷酸序列中添加、取代、缺失或修飾1個(gè)或多個(gè)堿基，并且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或，

7、(4)在嚴(yán)格條件下與seq?id?no.1所示序列雜交的核苷酸序列。

8、優(yōu)選地，所述ntcbl3a基因編碼蛋白的氨基酸序列包含如下(5)～(7)中的任一項(xiàng)：

9、(5)如seq?id?no.2所示的氨基酸序列；或，

10、(6)與seq?id?no.2所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或，

11、(7)在seq?id?no.2所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或修飾1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，并且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列。

12、本發(fā)明還提供一種包含所述的ntcbl3a基因的生物材料，所述生物材料為重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌。

13、本發(fā)明還提供上述生物材料提高鉀素能力的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

14、優(yōu)選地，所述提高鉀素能力為影響煙草轉(zhuǎn)基因植物中鉀素積累的能力，進(jìn)一步為提高煙草鉀素的積累。

15、優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因植物為煙草煙葉。

16、本發(fā)明還提供一種培育提高鉀素積累能力的轉(zhuǎn)基因植物的方法，通過(guò)將上述包含ntcbl3a基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入受體植物中得到轉(zhuǎn)基因植物，或通過(guò)crispr/cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，構(gòu)建用于敲除上述ntcbl3a基因的crispr/cas9基因編輯載體，經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化獲得ntcbl3a基因發(fā)生編輯的轉(zhuǎn)基因植物。

17、優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體中包含的啟動(dòng)子為35s啟動(dòng)子，所述重組表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體；所述重組表達(dá)載體包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域。

18、優(yōu)選的，所述重組表達(dá)載體中包含可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶基因或發(fā)光化合物的基因或具有抗性的抗生素標(biāo)記物基因或抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因。

19、優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體具體為pcambia-1300-221、pgreen0029、pcambia3301、pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia1301-ubin、pore-cas9、pylcrispr/cas9-mt、pcas9grna7、pcas9grna7-gfp或其它衍生植物表達(dá)載體。

20、使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，優(yōu)選花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動(dòng)子、泛素基因ubiquitin啟動(dòng)子(pubi)、脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29a等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。

21、此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。

22、翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用重組表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

23、更為具體的，所述重組表達(dá)載體為pdc45-cas9/grna-ntcbl3a基因敲除載體。

24、本發(fā)明還提供一種煙草品種，所述煙草品種采用上述方法培育得到的。

25、本發(fā)明有益效果是：

26、本發(fā)明的煙草cbl家族基因ntcbl3a是煙葉鉀含量積累的負(fù)調(diào)控因子。

27、本發(fā)明通過(guò)調(diào)節(jié)基因ntcbl3a表達(dá)水平控制煙草煙葉的鉀素積累，通過(guò)基因工程手段獲得ntcbl3a基因的轉(zhuǎn)基因作物，該技術(shù)符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展需求，對(duì)于增加煙草的新功能利用和研究煙草鉀素積累、培育高鉀煙草品種方面具有重要的實(shí)用價(jià)值和市場(chǎng)前景，敲除ntcbl3a基因能夠提高煙草植株鉀素的積累。

技術(shù)特征：

1.煙草cbl家族基因ntcbl3a在提高煙草鉀含量中的應(yīng)用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列包含如下(1)～(4)中的任一項(xiàng)：

2.如權(quán)利要求1所述煙草cbl家族基因ntcbl3a在提高煙草鉀含量中的應(yīng)用，其特征在于，所述ntcbl3a基因編碼蛋白的氨基酸序列分別包含如下(5)～(7)中的任一項(xiàng)：

3.一種包含權(quán)利要求1或2所述的ntcbl3a基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料為重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ntcbl3a基因或根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物材料在轉(zhuǎn)基因植物中提高鉀素能力的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述ntcbl3a基因能夠提高煙葉鉀含量。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物為煙草煙葉。

7.一種培育提高鉀素積累能力的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，通過(guò)將包含權(quán)利要求1所述的ntcbl3a基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入受體植物中得到轉(zhuǎn)基因植物，或通過(guò)crispr/cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，構(gòu)建用于敲除權(quán)利要求1所述的ntcbl3a基因的crispr/cas9基因編輯載體，經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化獲得ntcbl3a基因發(fā)生編輯的轉(zhuǎn)基因植物。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培育提高鉀素積累能力的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，所述重組表達(dá)載體中包含的啟動(dòng)子為35s啟動(dòng)子。

9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的培育提高鉀素積累能力的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于：所述重組表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體。

10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的培育提高鉀素積累能力的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于：所述重組表達(dá)載體包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種煙草CBL家族基因NtCBL3A在提高煙草鉀含量中的應(yīng)用煙草，所述基因NtCBL3A的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育提高鉀素積累能力的轉(zhuǎn)基因煙草植物，提高煙草鉀素積累能力、培育高鉀煙草。

技術(shù)研發(fā)人員：徐剛,寧揚(yáng),薛琳,農(nóng)童嘉,崔萌萌,石楚含,鄧帥軍,王倩,戴培剛
受保護(hù)的技術(shù)使用者：安徽皖南煙葉有限責(zé)任公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5