本申請屬于生物檢測，尤其涉及一種檢測馬爾尼菲籃狀菌的引物和探針、應(yīng)用以及試劑盒。

背景技術(shù)：

1、馬爾尼菲籃狀菌(talaromycesmarneffei)是一種主要分布于東南亞國家和中國南方地區(qū)的機(jī)會性致病真菌，免疫力低下人群尤其是艾滋病患者為易感人群。近年來，隨著艾滋病患者的增加，馬爾尼菲籃狀菌感染病例數(shù)也逐年上升，流行區(qū)域不斷擴(kuò)大。馬爾尼菲籃狀菌易引起播散型感染，病情重且死亡率高，早期診斷及時治療是降低病死率的關(guān)鍵。

2、目前病原學(xué)培養(yǎng)陽性為診斷馬爾尼菲籃狀菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但一般需要3～14天，早期診斷困難。半乳甘露聚糖(gm)試驗(yàn)和甘露聚糖蛋白(mp1p)抗原檢測等血清學(xué)診斷方法快速簡便，但靈敏度和特異性不足，一般只用于輔助診斷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本申請的目的在于提供一種檢測馬爾尼菲籃狀菌的引物和探針、應(yīng)用以及試劑盒，旨在解決如何更好地檢測馬爾尼菲籃狀菌的技術(shù)問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述申請目的，本申請采用的技術(shù)方案如下：

3、第一方面，本申請?zhí)峁┮环N檢測馬爾尼菲籃狀菌的引物和探針，包括：

4、上游引物，核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

5、下游引物，核苷酸序列如seq?id?no.2所示；

6、以及探針，核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

7、在一些實(shí)施例中，所述引物和探針用于檢測馬爾尼菲籃狀菌時的終濃度為：上游引物0.25～1.0μm，下游引物0.25～1.0μm，探針0.10～0.40μm。

8、在一些實(shí)施例中，所述引物和探針用于檢測馬爾尼菲籃狀菌時的終濃度為：上游引物0.5μm，下游引物0.5μm，探針0.25μm。

9、在一些實(shí)施例中，所述探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針的3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。

10、在一些實(shí)施例中，所述熒光報(bào)告基團(tuán)包括fam、vic、hex、tet、joe、cy3和cy5中的至少一種；

11、和/或，所述熒光淬滅基團(tuán)包括tamara、mgb、bhq-1、bhq-2和bhq-3中的至少一種。

12、第二方面，本申請?zhí)峁┮环N應(yīng)用，即本申請第一方面提供的引物和探針在制備基于液滴數(shù)字pcr檢測馬爾尼菲籃狀菌的試劑盒中的應(yīng)用。

13、第三方面，本申請?zhí)峁┮环N檢測馬爾尼菲籃狀菌的試劑盒，所述試劑盒包括本申請第一方面提供的引物和探針。

14、在一些實(shí)施例中，所述試劑盒基于液滴數(shù)字pcr檢測馬爾尼菲籃狀菌。

15、在一些實(shí)施例中，所述試劑盒還包括：液滴數(shù)字pcr體系試劑。

16、在一些實(shí)施例中，所述試劑盒還包括樣本核酸提取試劑。

17、本申請第一方面提供的檢測馬爾尼菲籃狀菌的引物和探針，是根據(jù)馬爾尼菲籃狀菌的its(internal?transcribed?spacer)即內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列，設(shè)計(jì)得到的可以基于液滴數(shù)字pcr(droplet?digital?polymerase?chain?reaction)擴(kuò)增目標(biāo)序列的高特異性的引物和探針，利用該引物和探針可以快速、準(zhǔn)確地檢測馬爾尼菲籃狀菌，不僅待檢測樣本用量少，不需要病原學(xué)培養(yǎng)，耗時短，而且對其他病原菌檢測無交叉反應(yīng)，特異性好，靈敏度高。因此，對馬爾尼菲籃狀菌早期診斷和治療具有重要的應(yīng)用價值。

18、本申請第二方面提供的應(yīng)用，是基于本申請第一方面提供的引物和探針可以基于液滴數(shù)字pcr快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測馬爾尼菲籃狀菌，因此該引物和探針可以用于制備基于液滴數(shù)字pcr檢測馬爾尼菲籃狀菌的試劑盒。

19、本申請第三方面提供的檢測馬爾尼菲籃狀菌的試劑盒含有本申請?zhí)赜械囊锖吞结?，基于該引物和探針的特性，本試劑盒可以快速、?zhǔn)確、靈敏地檢測馬爾尼菲籃狀菌病原體，為實(shí)現(xiàn)馬爾尼菲籃狀菌的早期診斷和基層流行病學(xué)調(diào)查提供可能。

技術(shù)特征：

1.一組檢測馬爾尼菲籃狀菌的引物和探針，其特征在于，包括：

2.如權(quán)利要求1所述的引物和探針，其特征在于，所述引物和探針用于檢測馬爾尼菲籃狀菌時的終濃度為：上游引物0.25～1.0μm，下游引物0.25～1.0μm，探針0.10～0.40μm。

3.如權(quán)利要求2所述的引物和探針，其特征在于，所述引物和探針用于檢測馬爾尼菲籃狀菌時的終濃度為：上游引物0.5μm，下游引物0.5μm，探針0.25μm。

4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的引物和探針，其特征在于，所述探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，所述探針的3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。

5.如權(quán)利要求4所述的引物和探針，其特征在于，所述熒光報(bào)告基團(tuán)包括fam、vic、hex、tet、joe、cy3和cy5中的至少一種；

6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的引物和探針在制備基于液滴數(shù)字pcr檢測馬爾尼菲籃狀菌的試劑盒中的應(yīng)用。

7.一種檢測馬爾尼菲籃狀菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的引物和探針。

8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒基于液滴數(shù)字pcr檢測馬爾尼菲籃狀菌。

9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：液滴數(shù)字pcr體系試劑。

10.如權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括樣本核酸提取試劑。

技術(shù)總結(jié)
本申請涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測馬爾尼菲籃狀菌的引物和探針、應(yīng)用以及試劑盒。檢測馬爾尼菲籃狀菌的引物和探針包括：上游引物，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；下游引物，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；以及探針，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。利用該引物和探針基于液滴數(shù)字PCR可以快速、準(zhǔn)確地檢測馬爾尼菲籃狀菌，不僅待檢測樣本用量少，不需要病原學(xué)培養(yǎng)，耗時短，而且對其他病原菌檢測無交叉反應(yīng)，特異性好，靈敏度高。因此，對馬爾尼菲籃狀菌早期診斷和治療具有重要的應(yīng)用價值。

技術(shù)研發(fā)人員：李凌華,楊穎茵,郭朋樂,陳諧捷,許飛龍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26