本發(fā)明涉及pcr鑒定，更具體的說是涉及一種血液直接pcr鑒定基因修飾雞的方法。

背景技術(shù)：

1、雞已被廣泛用于早期胚胎發(fā)生、毒理學(xué)和干細(xì)胞等研究，特別是鳥類基因修飾（轉(zhuǎn)基因和基因組編輯等）研究。原始生殖細(xì)胞（primordial?germ?cells，pgcs）是精原細(xì)胞和卵原細(xì)胞的祖先細(xì)胞，能將遺傳信息傳遞給下一代。pgcs經(jīng)過體外培養(yǎng)及基因修飾后，仍保持其生物學(xué)特性，移植回注到雞胚血脈系統(tǒng)后可遷移到性腺并發(fā)育成功能性配子，產(chǎn)生基因修飾后代。pgcs結(jié)合crispr/cas9技術(shù)產(chǎn)生基因組修飾雞，在鳥類中是應(yīng)用最廣、最成熟的基因組修飾模型，包括loxp位點(diǎn)導(dǎo)入雞igh位點(diǎn)、gfp基因插入z染色體、抗j亞型禽白血病雞和抗禽流感等模型。

2、在基于雞pgcs生產(chǎn)基因修飾雞過程中，需要經(jīng)歷3個(gè)世代（g0、g1和g2世代），每個(gè)世代均要進(jìn)行pcr鑒定以明確基因修飾的陽性雞只，工作量非常大。比如，g1代時(shí)，若要獲得200只陽性g1代母雞用于生產(chǎn)g2代，按照陽性雞比率約20%計(jì)算，需要對(duì)2000只以上的g1代雞進(jìn)行pcr鑒定（公母比例1:1計(jì)算）?，F(xiàn)有的pcr鑒定方法，一般是采集血液或組織抽提dna后，再以抽提的dna為模板進(jìn)行pcr鑒定。而且，為了獲得足量的血液，一般對(duì)1日齡雛雞進(jìn)行心臟采血，繁瑣且雞只應(yīng)激大。

3、綜上，如何提供一種簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確的基因修飾雞的鑒定方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種血液直接pcr鑒定基因修飾雞的方法。

2、本發(fā)明的難點(diǎn)：

3、（1）由于在采血過程中，紅細(xì)胞的量難以把控，所以在裂解紅細(xì)胞時(shí)添加多少量的純水，以及加入純水后震蕩裂解多長時(shí)間需要不斷摸索。

4、（2）由于血液模板中含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)，選擇合適的taq酶至關(guān)重要。

5、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

6、一種血液直接pcr鑒定基因修飾雞的方法，包括如下步驟：

7、（1）采集雞血加入含有edta的離心管中，得預(yù)處理液；

8、（2）離心棄上清，之后加入純水、充分震蕩，靜置后吸上清作為模板；

9、（3）進(jìn)行pcr反應(yīng)。

10、進(jìn)一步的，所述雞血為腳趾血。

11、進(jìn)一步的，所述步驟（1）中，10~20?μl雞血加入到150?μl質(zhì)量濃度為1.5%的edta溶液中。

12、進(jìn)一步的，所述步驟（2）中，離心的參數(shù)為3000轉(zhuǎn)離心3min。

13、進(jìn)一步的，所述步驟（2）中，預(yù)處理液和純水的體積比為15:10。

14、進(jìn)一步的，所述步驟（2）中，震蕩時(shí)間為3~5min。

15、進(jìn)一步的，所述步驟（2）中，靜置時(shí)間為10min。

16、進(jìn)一步的，所述步驟（3）中，pcr反應(yīng)加入的taq酶為艾科瑞生物公司的apexhf?hsdna聚合酶預(yù)混液-fs（含染料）。

17、進(jìn)一步的，所述基因修飾雞中的外源基因?yàn)閕caspase9-ha-t2a-egfp，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

18、經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得的有益效果為：

19、（1）本申請(qǐng)直接采集雞腳趾血進(jìn)行pcr鑒定，血液采集方法簡(jiǎn)單，不需要抽提dna，降低了成本，且大大減少了工作量。

20、（2）紅細(xì)胞在低滲環(huán)境中裂解會(huì)釋放基因組dna，以此作為模板，只需要挑選特異性較強(qiáng)、耐受復(fù)雜模板的酶，設(shè)計(jì)合適的引物就可以擴(kuò)增基因組中的目的片段。

21、（3）本申請(qǐng)獲得的基因編輯雞可以通過b/b藥物誘導(dǎo)內(nèi)源性pgc凋亡，建立“代孕”中間宿主雞群體，如此，可以注射外源性pgc（任何其他雞品種）到“代孕”中間宿主雞群體中，使外源性pgc（而且僅有外源性pgc）在體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，到性成熟即可配種，利用“代孕”雞創(chuàng)建一種全新的家禽離體保種方式，大幅提高地方雞保種效率，為家禽種質(zhì)資源離體保存奠定了良好基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種血液直接pcr鑒定基因修飾雞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述雞血為腳趾血。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，10~20?μl雞血加入到150?μl質(zhì)量濃度為1.5%的edta溶液中。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，離心的參數(shù)為3000轉(zhuǎn)離心3min。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，預(yù)處理液和純水的體積比為15:10。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，震蕩時(shí)間為3~5min。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，靜置時(shí)間為10min。

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3）中，pcr反應(yīng)加入的taq酶為apexhf?hs?dna聚合酶預(yù)混液-fs。

9.如權(quán)利要求1~8任一所述的方法，其特征在于，所述基因修飾雞中的外源基因?yàn)閕caspase9-ha-t2a-egfp，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種血液直接PCR鑒定基因修飾雞的方法。屬于PCR鑒定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法包括如下步驟：采集雞血加入含有EDTA的離心管中，得預(yù)處理液；離心棄上清，之后加入純水、充分震蕩，靜置后吸上清作為模板；進(jìn)行PCR反應(yīng)。本申請(qǐng)直接采集雞腳趾血進(jìn)行PCR鑒定，血液采集方法簡(jiǎn)單，不需要抽提DNA，降低了成本，且大大減少了工作量。

技術(shù)研發(fā)人員：鄒嫻,羅成龍,張劍南,舒鼎銘,何燕華,孫晟睿,陳緒祿,趙智鋒
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/14