本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的重組大腸桿菌及構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、(-)-異胡薄荷醇((-)-isopulegol)，是一種廣泛存在于草本和木本植物中具有芳香味道的天然產(chǎn)物。由于具有清涼的樟腦、薄荷香氣和玫瑰香味，所以被廣泛用于香精香料加工行業(yè)。除此之外，由于(-)-異胡薄荷醇分子結(jié)構(gòu)中含有三個(gè)手性中心，在化學(xué)合成中常被用于復(fù)雜化合物的手性構(gòu)建。目前，作為新質(zhì)生產(chǎn)力的重要手段，合成生物學(xué)被用于合成眾多化學(xué)品。單萜的微生物合成是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一，(-)-異胡薄荷醇作為其中重要的成分，其從頭合成受到廣泛關(guān)注。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的重組大腸桿菌。

2、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述一種生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法。

3、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述一種生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的應(yīng)用。

4、本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

5、一種生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

6、(1)用em1核苷酸片段替換petduet-1的表達(dá)模塊核苷酸片段得到質(zhì)粒1；用em2核苷酸片段替換prsfduet-1的表達(dá)模塊核苷酸片段得到質(zhì)粒2；所述em1核苷酸片段的序列如seq?id?no.1所示；所述em2核苷酸片段的序列如seq?id?no.2所示；所述質(zhì)粒1的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；所述質(zhì)粒2的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

7、(2)將優(yōu)化后并截短71個(gè)氨基酸的香葉醇合酶基因ob71ges整合到質(zhì)粒1的第一個(gè)啟動(dòng)子的rbs后，將優(yōu)化后的香葉基焦磷酸合酶基因aggpps整合到第二個(gè)啟動(dòng)子的rbs后，將優(yōu)化后的香茅醛環(huán)化酶基因zmshcf486c整合到第三個(gè)啟動(dòng)子的rbs后，將優(yōu)化后的香葉醇脫氫酶基因ecgedh整合到的bamhi酶切位點(diǎn)后，將優(yōu)化后的烯烴還原酶基因ppnerma整合到香葉基焦磷酸合酶基因aggpps后，得到質(zhì)粒3；

8、所述優(yōu)化后并截短71個(gè)氨基酸的香葉醇合酶基因ob71ges的核苷酸序列如seq?idno.5所示；所述優(yōu)化后的香葉基焦磷酸合酶基因aggpps的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；所述優(yōu)化后的香茅醛環(huán)化酶基因zmshcf486c的核苷酸序列如seq?id?no.9所示；所述優(yōu)化后的香葉醇脫氫酶基因ecgedh的核苷酸序列如seq?id?no.7所示；所述優(yōu)化后的烯烴還原酶基因ppnerma的核苷酸序列如seq?id?no.8所示；所述質(zhì)粒3的核苷酸序列如seq?id?no.10所示；

9、(3)將優(yōu)化后的香茅醛環(huán)化酶基因zmshcf486c整合到質(zhì)粒2的第一個(gè)啟動(dòng)子的rbs后，得到質(zhì)粒4；所述質(zhì)粒4的核苷酸序列如seq?id?no.11所示；

10、(4)敲除掉質(zhì)粒pjbei-6409中香葉基焦磷酸合酶基因aggpps(genebank：kt894143.1)和檸檬烯合酶基因mclms(genebank：l13459.1)，得到質(zhì)粒5；所述質(zhì)粒5的核苷酸序列如seq?id?no.12所示；

11、(5)將質(zhì)粒3、質(zhì)粒4和質(zhì)粒5導(dǎo)入大腸桿菌dh5α中，得到生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的重組大腸桿菌7。

12、上述方法構(gòu)建的生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的重組大腸桿菌7。

13、上述生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的重組大腸桿菌7發(fā)酵生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的應(yīng)用，包括如下步驟：

14、(1)種子培養(yǎng)：將-80℃保存的的重組大腸桿菌6和重組大腸桿菌7分別在lb固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)；接種到lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別得到重組大腸桿菌6種子液和重組大腸桿菌7種子液；

15、所述重組大腸桿菌6用下述步驟構(gòu)建：將優(yōu)化后的香茅醛環(huán)化酶基因zmshcf486c整合到質(zhì)粒pcoldii的ndei酶切位點(diǎn)后，將氯霉素抗性基因eccmr整合到hindiii酶切位點(diǎn)后，得到質(zhì)粒6，將質(zhì)粒6導(dǎo)入到大腸桿菌dh5α中，得到重組大腸桿菌6；所述氯霉素抗性基因eccmr的核苷酸序列如seq?id?no.58所示；所述質(zhì)粒6的核苷酸序列如seq?id?no.13所示；

16、(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)與細(xì)胞富集：將步驟(1)獲得的重組大腸桿菌6種子液接種到tb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至od600達(dá)到0.8-1.0時(shí)，添加終濃度0.5mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在20℃培養(yǎng)12-24h；4℃，12000rpm離心2min收集細(xì)胞，使用ph＝7.4的pbs重懸菌體，再次4℃，12000rpm離心2min收集重組大腸桿菌6；

17、(3)將步驟(1)獲得的重組大腸桿菌7種子液接種到tb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至od600達(dá)到0.8-1.0時(shí)，添加終濃度0.5mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷，添加體積比為10％的肉豆蔻酸異丙酯，20℃發(fā)酵培養(yǎng)24-48h；加入終濃度為0.1g/ml的重組大腸桿菌6；繼續(xù)發(fā)酵24-48h，收集上層有機(jī)相，得到(-)-異胡薄荷醇。

18、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明構(gòu)建的生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的重組大腸桿菌，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的方法，發(fā)酵后(-)-異胡薄荷醇搖瓶產(chǎn)量達(dá)到12.4mg/l。為(-)-異胡薄荷醇的微生物法從頭合成并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)建立了良好的基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟：

2.權(quán)利要求1的方法構(gòu)建的生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的重組大腸桿菌7。

3.權(quán)利要求2的生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的重組大腸桿菌7發(fā)酵生產(chǎn)(-)-異胡薄荷醇的應(yīng)用，其特征是包括如下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)(?)?異胡薄荷醇的重組大腸桿菌及構(gòu)建方法與應(yīng)用，構(gòu)建方法的步驟為：先構(gòu)建質(zhì)粒1和質(zhì)粒2；在質(zhì)粒1的基礎(chǔ)上構(gòu)建質(zhì)粒3，在質(zhì)粒2的基礎(chǔ)上構(gòu)建質(zhì)粒4，敲除掉質(zhì)粒pJBEI?6409中香葉基焦磷酸合酶基因AgGPPS和檸檬烯合酶基因McLMS，得到質(zhì)粒5；將質(zhì)粒3、質(zhì)粒4和質(zhì)粒5導(dǎo)入大腸桿菌DH5α中，得到生產(chǎn)(?)?異胡薄荷醇的重組大腸桿菌7，實(shí)驗(yàn)證明，重組大腸桿菌6和7混合發(fā)酵得到(?)?異胡薄荷醇，其(?)?異胡薄荷醇搖瓶產(chǎn)量達(dá)到12.4mg/L。

技術(shù)研發(fā)人員：盧文玉,張金宏,張占維,汪振洋,張傳波
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中化健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26