本發(fā)明涉及生物，更具體的說是涉及一種直接以血液為模板的雞胚胎性別鑒定試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、禽類早期性別鑒定對于家禽生產(chǎn)具有重要的經(jīng)濟(jì)和科研意義。在生產(chǎn)上，性別鑒定可以優(yōu)化家禽的飼養(yǎng)管理，提高生產(chǎn)效率。早期性別鑒定技術(shù)可以減少不必要的資源浪費(fèi)，例如在孵化過程中，可以根據(jù)性別鑒定結(jié)果對不同性別的禽類進(jìn)行合理分配和管理，提高養(yǎng)殖效率。同時(shí)，這項(xiàng)技術(shù)還能避免因性別錯誤鑒定而導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失，尤其是在肉雞和蛋雞產(chǎn)業(yè)中，性別鑒定對于優(yōu)化生產(chǎn)策略至關(guān)重要。禽類早期性別鑒定在科研領(lǐng)域具有重要意義。它不僅有助于進(jìn)一步理解禽類性別決定的遺傳和分子機(jī)制，還有助于研究禽類的繁殖育種、遺傳疾病防治、種群結(jié)構(gòu)和群體遺傳分析。通過早期性別鑒定技術(shù)，研究人員能夠更準(zhǔn)確地分析性別比例、遺傳多樣性以及性別特異性的性狀表現(xiàn)，從而為家禽品種的改良和優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。

2、現(xiàn)有鑒定雞胚性別的方法有尿囊液測定雌激素、pcr法、血管粗細(xì)、人工智能驅(qū)動的mri技術(shù)等。由于成本高、復(fù)雜等缺點(diǎn)，血管粗細(xì)、人工智能驅(qū)動的mri技術(shù)目前推廣應(yīng)用不高。常用的方法是尿囊液測定雌激素和pcr法，比較成熟的雞胚性別鑒定方法是采集9日齡以上的雞胚尿囊液，用elisa方法測定雌激素含量，含量高的為雌性，無雌激素含量的為雄性，該方法只能鑒定9日齡以上的雞胚。

3、分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為禽類早期性別鑒定提供了新的方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）或環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（lamp）技術(shù)，這些方法可以通過分析雞胚性染色體上的特定基因來實(shí)現(xiàn)性別鑒定。例如，通過檢測染色體螺旋蛋白基因（chd1基因）的內(nèi)含子基因序列差異，可以對雞的性別進(jìn)行鑒定。pcr憑借著快速、靈敏、簡便及特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在性別鑒定領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。隨著技術(shù)的發(fā)展，pcr性別鑒定方法已經(jīng)從簡單pcr法、雙重或多重pcr法、巢式pcr法發(fā)展到改進(jìn)的兩溫度梯度pcr法。在實(shí)際應(yīng)用中，血液pcr技術(shù)已被用于家禽，特別是雞的性別鑒定。pcr法主要是采集雞胚組織抽提dna后進(jìn)行pcr鑒定。研究表明，通過血液、羽毛等材料提取dna后的pcr方法可以準(zhǔn)確快速地鑒定雞和雞胚的性別，這對于家禽育種過程中的性別控制具有重要意義。

4、以上策略基于血液或者組織對其進(jìn)行dna提取并進(jìn)行pcr-瓊脂糖凝膠電泳鑒定為我們解決了家禽早期性別鑒定的難題。但是由于dna的提取過程繁瑣，通常適用于科研領(lǐng)域或高價(jià)值家禽品種以及珍稀禽類種群的保護(hù)和遺傳資源的保存，不利于在生產(chǎn)中大批量應(yīng)用。以血液為模板直接進(jìn)行pcr則存在一些問題。血液中的某些成分可能會抑制pcr反應(yīng)，如血紅蛋白、乳鐵蛋白和免疫球蛋白等，可能會影響pcr擴(kuò)增效率，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。此外，一些外源添加的抗凝劑也會對pcr反應(yīng)有一定的抑制作用。因此現(xiàn)有的血液pcr體系中需要引入pcr反應(yīng)增強(qiáng)劑和pcr體系穩(wěn)定劑。常用的pcr反應(yīng)增強(qiáng)劑包括甜菜堿、海藻糖、二甲亞砜、明膠和甘油等，pcr體系穩(wěn)定劑包括tween20、np40、triton?x-100等。由于雞胚胎血液采集通常伴有其他蛋白污染，因此需要對雞胚血液pcr進(jìn)一步優(yōu)化。

5、綜上，如何提供一種雞胚血液直接pcr的性別鑒定方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種直接以血液為模板的雞胚胎性別鑒定試劑盒及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明的方法可以應(yīng)用到所有天齡的雞胚中，即只要雞胚中有血可以取，即可通過血液直接pcr法鑒定雞胚性別。

3、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

4、一種直接以血液為模板的雞胚胎性別鑒定試劑盒，包括taq?dna聚合酶、上游引物、下游引物和水；

5、引物序列如下：

6、上游引物：5’-gttactgattcgtctacgaga-3’，seq?id?no.1；

7、下游引物：5’-attgaaatgatccagtgcttg-3’，seq?id?no.2。

8、進(jìn)一步的，所述taq?dna聚合酶為genestar?2x?surpernova超保真pcr預(yù)混液。

9、進(jìn)一步的，包括genestar?2x?surpernova超保真pcr預(yù)混液10?μl、ddh2o?6?μl、10μmol/l的上游引物1?μl、10?μmol/l的下游引物1?μl。

10、一種直接以血液為模板的雞胚胎性別鑒定方法，使上述的試劑盒。

11、進(jìn)一步的，包括如下步驟：

12、(1)從雞胚中抽取10?μl血液，置于含edta的離心管中；

13、(2)離心棄上清，加入ddh2o稀釋血液至豆沙色，劇烈震蕩使其進(jìn)行分層，取上清作為模板；

14、(3)采用所述試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

15、進(jìn)一步的，所述步驟(2)中，離心參數(shù)為1000?×g離心3?min。

16、進(jìn)一步的，所述步驟(3)中，pcr擴(kuò)增條件為：

17、步驟一：95℃預(yù)變性5?min；

18、步驟二：94℃變性30?s，57℃退火45?s，72℃延伸30?s，循環(huán)34次；

19、步驟三：72℃延伸7?min。

20、進(jìn)一步的，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物只出現(xiàn)一條550?bp特異性擴(kuò)增條帶時(shí)，判定為雄性，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)出現(xiàn)450?bp和550?bp兩條特異性擴(kuò)增條帶時(shí)，判定為雌性。

21、經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得的有益效果為：

22、本發(fā)明采用超保真taq?dna聚合酶優(yōu)化pcr反應(yīng)體系，全血經(jīng)稀釋后直接作為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)，無需進(jìn)行繁瑣的dna提取，同時(shí)反應(yīng)體系中無需添加pcr反應(yīng)增強(qiáng)劑和pcr體系穩(wěn)定劑，具有操作簡單方便、耗時(shí)少、鑒別快速等優(yōu)點(diǎn)，避免傳統(tǒng)方法耗時(shí)耗力、容易出錯的缺點(diǎn)。

技術(shù)特征：

1.一種直接以血液為模板的雞胚胎性別鑒定試劑盒，其特征在于，包括taq?dna聚合酶、上游引物、下游引物和水；

2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述taq?dna聚合酶為genestar?2xsurpernova超保真pcr預(yù)混液。

3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，包括genestar?2x?surpernova超保真pcr預(yù)混液10?μl、ddh2o?6?μl、10?μmol/l的上游引物1?μl、10?μmol/l的下游引物1?μl。

4.一種直接以血液為模板的雞胚胎性別鑒定方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1~3任一所述的試劑盒。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，離心參數(shù)為1000?×g離心3min。

7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，pcr擴(kuò)增條件為：

8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物只出現(xiàn)一條550?bp特異性擴(kuò)增條帶時(shí)，判定為雄性，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)出現(xiàn)450?bp和550?bp兩條特異性擴(kuò)增條帶時(shí)，判定為雌性。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種直接以血液為模板的雞胚胎性別鑒定試劑盒及其應(yīng)用。屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述試劑盒包括Taq?DNA聚合酶、上游引物、下游引物和水。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得的有益效果為：本發(fā)明采用超保真Taq?DNA聚合酶優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，全血經(jīng)稀釋后直接作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，無需進(jìn)行繁瑣的DNA提取，同時(shí)反應(yīng)體系中無需添加PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑和PCR體系穩(wěn)定劑，具有操作簡單方便、耗時(shí)少、鑒別快速等優(yōu)點(diǎn)，避免傳統(tǒng)方法耗時(shí)耗力、容易出錯的缺點(diǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：鄒嫻,羅成龍,舒鼎銘,呂曉慧,何燕華,張鴻彬,趙智鋒
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10