本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種可提高aav病毒對(duì)非人靈長(zhǎng)類（non-human?primates，nhp）眼組織感染能力的衣殼蛋白突變體aav2-ne01和aav2-ne02及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、腺相關(guān)病毒(aav)的基因組為4.7kb左右的單鏈dna片段，包含于直徑20nm的正二十面體非包膜病毒衣殼中，可分成三個(gè)功能區(qū)域：兩個(gè)開放閱讀框(rep基因、cap基因)和末端反向重復(fù)序列(itr)。其中，cap基因的開放閱讀框編碼三個(gè)衣殼蛋白vp1、vp2和vp3，分子量為別為87、73、61kda，是裝配成完整病毒所需的衣殼蛋白，它們?cè)诓《菊?、?fù)制和裝配中起重要作用。

2、aav是一種廣泛應(yīng)用于基因治療的遞送載體，其原理是通過基因工程方法將aav基因組itr之間序列替換成目的基因序列，經(jīng)細(xì)胞感染傳遞到靶細(xì)胞，達(dá)到基因治療目的?；谥亟Maav具有安全性、高效性、穩(wěn)定性、持續(xù)性、特異性、低整合性等特點(diǎn)，使得aav成為基因治療領(lǐng)域主要遞送手段之一。

3、但aav仍面臨多項(xiàng)挑戰(zhàn)：一是、生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本昂貴，產(chǎn)能受限；二是、高劑量給藥，可能表現(xiàn)出神經(jīng)毒性和肝毒性，造成安全性問題。三是、對(duì)部分組織細(xì)胞的感染能力較弱，如玻璃體腔給藥難以感染視網(wǎng)膜后層細(xì)胞，靜脈給藥難以感染中樞神經(jīng)細(xì)胞。對(duì)aav衣殼蛋白進(jìn)行改造及篩選，提高其對(duì)特定組織的靶向性及轉(zhuǎn)染效率，以期實(shí)現(xiàn)更低、更安全的給藥劑量，是解決該問題的有效途徑。

4、眼睛由于血眼屏障的存在，具有一定的免疫豁免，局部給藥相對(duì)安全性較高，且眼底疾病多為單基因遺傳病，因此眼科成為基因治療的熱點(diǎn)領(lǐng)域。臨床常用的注射方式有玻璃體腔注射和視網(wǎng)膜下注射兩種，視網(wǎng)膜下注射感染效果較好，尤其是對(duì)rpe層和外核層，但此方法侵入性較大，易造成視網(wǎng)膜脫離，可能導(dǎo)致光感受器退化、視功能損傷及膠質(zhì)細(xì)胞增生。玻璃體腔注射，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)較小，但像aav2、aav5等常規(guī)血清型僅能感染rgc層，對(duì)視錐、視桿細(xì)胞及rpe感染效果差。因此，開發(fā)能提高全眼表達(dá)能力，或可穿透rgc層和內(nèi)核層感染外核層細(xì)胞及rpe細(xì)胞的aav突變體，對(duì)解決眼科基因治療遞送載體問題有重要意義。

5、過往研究顯示在cap的587和588位點(diǎn)之間插入多肽片段可以優(yōu)化其對(duì)食蟹猴眼組織的感染能力，在先的專利申請(qǐng)cn?116836237a、cn?117143203?a公開了一些衣殼蛋白突變體，數(shù)據(jù)顯示不同的片段插入有不同的效果。但是通過該方法能否獲得可以提高aav病毒對(duì)nhp的視網(wǎng)膜組織的感染能力，有待進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的至少一個(gè)不足，提供提高aav對(duì)眼組織感染能力的衣殼蛋白突變體及應(yīng)用。

2、本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供：提高aav對(duì)眼組織感染能力的衣殼蛋白突變體，通過在aav衣殼蛋白插入多肽aavrfdgteraa或rqysdavrae得到，插入位點(diǎn)與野生型aav2病毒衣殼蛋白587與588位氨基酸同源。

4、在一些衣殼蛋白突變體的實(shí)例中，通過在aav2變體的衣殼蛋白插入多肽aavrfdgteraa或rqysdavrae得到，插入位點(diǎn)與野生型aav2病毒衣殼蛋白587與588位氨基酸同源。

5、在一些衣殼蛋白突變體的實(shí)例中，通過在野生型aav2衣殼蛋白587與588位氨基酸之間插入多肽aavrfdgteraa或rqysdavrae得到。

6、在一些衣殼蛋白突變體的實(shí)例中，野生型aav2衣殼蛋白的氨基酸序列的genbank登陸號(hào)為yp_680426.1。

7、本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供：編碼本發(fā)明第一個(gè)方面所述衣殼蛋白突變體的基因。

8、在一些基因的實(shí)例中，根據(jù)表達(dá)體系進(jìn)行密碼子優(yōu)化。

9、本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供：一種表達(dá)載體，其表達(dá)本發(fā)明第一個(gè)方面所述的衣殼蛋白突變體，或插入有本發(fā)明第二個(gè)方面所述的基因。

10、在一些表達(dá)載體的實(shí)例中，所述表達(dá)載體為質(zhì)粒、重組aav載體中一種。

11、在一些表達(dá)載體的實(shí)例中，所述aav選自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9或aav10及其變體中的一種。

12、在一些表達(dá)載體的實(shí)例中，還包括編碼功能性基因產(chǎn)物的基因。

13、本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供：一種aav病毒顆粒，其外殼本發(fā)明第一個(gè)方面所述的衣殼蛋白突變體形成的衣殼蛋白vp1、vp2和vp3組裝形成，或由本發(fā)明第二個(gè)方面所述基因編碼形成的衣殼蛋白vp1、vp2和vp3組裝形成。

14、本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供：一種組合物，包括本發(fā)明第三個(gè)方面所述表達(dá)載體，或本發(fā)明第四個(gè)方面所述的aav病毒顆粒。

15、本發(fā)明的第六個(gè)方面，提供：本發(fā)明第五個(gè)方面所述的組合物的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括：

16、制備靶向眼組織的基因治療制劑；

17、構(gòu)建眼組織疾病轉(zhuǎn)基因模型動(dòng)物；

18、制備靶向眼組織的藥物或轉(zhuǎn)基因載體。

19、本發(fā)明的有益效果是：

20、本發(fā)明的一些實(shí)例的衣殼蛋白突變體，與其他衣殼結(jié)構(gòu)蛋白亞基組裝得到的完整aav衣殼蛋白，可以有效提高aav病毒對(duì)眼組織的感染能力。

技術(shù)特征：

1.提高aav對(duì)眼組織感染能力的衣殼蛋白突變體，其特征在于，通過在aav衣殼蛋白插入多肽aavrfdgteraa或rqysdavrae得到，插入位點(diǎn)與野生型aav2病毒衣殼蛋白587與588位氨基酸同源；優(yōu)選的，通過在aav2變體的衣殼蛋白插入多肽aavrfdgteraa或rqysdavrae得到，插入位點(diǎn)與野生型aav2病毒衣殼蛋白587與588位氨基酸同源。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的衣殼蛋白突變體，其特征在于，通過在野生型aav2衣殼蛋白587與588位氨基酸之間插入多肽aavrfdgteraa或rqysdavrae得到。

3.編碼權(quán)利要求1或2所述衣殼蛋白突變體的基因。

4.一種表達(dá)載體，其特征在于，其表達(dá)權(quán)利要求1或2所述的衣殼蛋白突變體，或插入有權(quán)利要求3所述的基因。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為質(zhì)粒、重組aav載體中一種。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述aav選自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9或aav10及其變體中的一種。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于，還包括編碼功能性基因產(chǎn)物的基因。

8.一種aav病毒顆粒，其特征在于，其外殼由權(quán)利要求1或2所述的衣殼蛋白突變體形成的衣殼蛋白vp1、vp2和vp3組裝形成，或由權(quán)利要求3所述基因編碼形成的衣殼蛋白vp1、vp2和vp3組裝形成。

9.一種組合物，其特征在于，包括權(quán)利要求4～7任一項(xiàng)所述表達(dá)載體，或權(quán)利要求8所述的aav病毒顆粒。

10.權(quán)利要求9所述的組合物的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了提高AAV對(duì)眼組織感染能力的衣殼蛋白突變體及應(yīng)用。通過在相當(dāng)于野生型AAV2病毒衣殼蛋白的587與588位氨基酸插入AAVRFDGTERAA、RQYSDAVRAE得到衣殼蛋白突變體AAV2?NE01和AAV2?NE02。AAV2?NE01和AAV2?NE02病毒產(chǎn)量為AAV2?WT的1.96倍和1.20倍，經(jīng)玻璃體腔注射后，能較好的感染NHP視網(wǎng)膜GCL、INL至ONL的各層細(xì)胞及小梁網(wǎng)區(qū)域，感染陽性率高，熒光強(qiáng)度強(qiáng)，對(duì)視網(wǎng)膜穿透能力強(qiáng)，能感染視細(xì)胞核部及內(nèi)段。具有良好的應(yīng)用前景，有望開發(fā)為治療眼部疾病的AAV載體。

技術(shù)研發(fā)人員：袁麗,張倩,任盛,霍嚳賡,高翠,伍辰光,鄭琴,劉蕾,孟珊,劉華清
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州譯碼基因科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10