本發(fā)明屬于植物分子遺傳育種研究領(lǐng)域，提供了一種甜瓜葉色黃化性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記site1888及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、甜瓜(cucumis?melo?l.)是葫蘆科重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，以其獨(dú)特的色、香、味而廣受消費(fèi)者喜愛，在國內(nèi)外均有著廣泛的栽培。葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要場所，葉片的顏色在很大程度上決定了植株的總光合生產(chǎn)力。然而，在甜瓜的栽培和育種過程中，常會遇到各種變異現(xiàn)象，其中葉色黃化突變體是較為常見的一種突變。葉色黃化突變體植株的葉綠素含量較低，光合速率下降，引起矮化、減產(chǎn)、致死等現(xiàn)象，對作物生長和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品的產(chǎn)量產(chǎn)生了嚴(yán)重的負(fù)面影響。在甜瓜中葉色黃化突變體子葉期即開始表現(xiàn)黃化，且黃化性狀伴隨整個生育周期。此外，黃化突變體甜瓜的植株矮化、細(xì)弱，果實偏小、商品性差，口感不佳、結(jié)實率低，嚴(yán)重影響了甜瓜的商品屬性，直接導(dǎo)致了果農(nóng)的甜瓜產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)價值下降。葉色黃化突變體的果實在成熟前果皮呈黃色，且幼果膨大遲緩，這種外觀特征大大降低果實的商品性，因此及時預(yù)測并剔除甜瓜葉色黃化突變體，有利于促進(jìn)甜瓜產(chǎn)品質(zhì)量的提高。解析甜瓜葉色黃化突變體形成發(fā)育的遺傳基礎(chǔ)與調(diào)控機(jī)理為研究葉色黃化突變體提供參考價值，對加快甜瓜葉色研究與分子育種進(jìn)程具有重要的現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明基于背景技術(shù)部分的研究，提供一種甜瓜葉色黃化性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記site1888及其應(yīng)用，利用葉色黃化突變體甜瓜品種zt00091為母本，正常葉色甜瓜品種zt249為父本，配置雜交組合獲得f1，對所獲得f1連續(xù)自交，得到其f2、f2:3家系，并將f2群體用于甜瓜葉色黃化性狀初步定位、f2:3家系用于候選基因精細(xì)定位。根據(jù)bsa(bulksegregatinganalysis)測序結(jié)果，獲得的8.49mb通過f2:3家系進(jìn)一步精細(xì)定位縮小候選區(qū)間，選擇效率更高的甜瓜葉色黃化性狀連鎖的分子標(biāo)記，可直接用于鑒定甜瓜植株后代是否會出現(xiàn)葉色黃化突變體。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

3、甜瓜葉色黃化性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記site1888，所述分子標(biāo)記site1888的引物序列為：

4、site1888f：tcccataccacaaacacacaa，

5、site1888r：aacttgttcagccggattca。

6、上述的分子標(biāo)記site1888在苗期鑒定甜瓜植株后代出現(xiàn)葉色黃化突變體的應(yīng)用。

7、進(jìn)一步地，所述應(yīng)用為：將該分子標(biāo)記在若干個甜瓜自然群體幼苗期進(jìn)行早期預(yù)測，用待選材料dna為模板，分子標(biāo)記site1888的引物對其進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并結(jié)合田間性狀分析。

8、進(jìn)一步地，所述應(yīng)用為：

9、(1)以待鑒定材料dna為模板，分子標(biāo)記site1888的引物對其進(jìn)行pcr擴(kuò)增；pcr產(chǎn)物檢測：反應(yīng)產(chǎn)物在7％的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸銀染色；

10、(2)標(biāo)記引物鑒定：待測dna樣品經(jīng)過pcr擴(kuò)增后，使用電泳方式能檢測，209bp特異條帶為葉色黃化突變體品種，232bp和209bp雜合條帶為中間型品種，232bp條帶為正常葉色品種。

11、進(jìn)一步地，步驟(1)中，pcr擴(kuò)增體系為10μl：包括site1888f?1μl、site1888r?1μl、taq?master?mix?3μl、dna模板1μl、ddh2o?4μl。

12、進(jìn)一步地，步驟(1)中，pcr擴(kuò)增程序：在95℃下預(yù)變性5min，在95℃變性30s，在55℃退火30s，在72℃延伸45s，(95℃變性30s，在55℃退火30s，72℃延伸45s重復(fù)35個循環(huán))，72℃延伸10min，4℃保存。

13、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為：

14、1、indel(insertion-deletion)分子標(biāo)記，是一種基于插入/缺失位點(diǎn)兩側(cè)的序列設(shè)計特異引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增的標(biāo)記，其本質(zhì)仍屬于長度多態(tài)性標(biāo)記，可利用聚丙烯凝膠電泳進(jìn)行分型。本發(fā)明根據(jù)bsa測序技術(shù)，比對甜瓜基因組數(shù)據(jù)，設(shè)計開發(fā)與甜瓜葉色黃化性狀連鎖標(biāo)記的indel標(biāo)記，通過indel分子標(biāo)記輔助育種的方法，在甜瓜幼苗期即可鑒別甜瓜植株后代出現(xiàn)葉色黃化突變體的概率。通過利用這一分子標(biāo)記，極大的減少了人力物力的投入，降低了育種成本，并縮短了育種的年限。

15、2、通過利用本發(fā)明提供的特異性引物對采用pcr方法檢測待測甜瓜的基因組dna，擴(kuò)增indel分子標(biāo)記site1888，甜瓜葉色黃化突變體材料基因擴(kuò)增產(chǎn)物為209bp，甜瓜正常葉色性狀材料其基因擴(kuò)增產(chǎn)物為232bp，通過此分子標(biāo)記育種工作者可以更有效地預(yù)測和篩選具有甜瓜葉色黃化遺傳特性的甜瓜植株，大大提升了甜瓜的育種效率。

16、3、本發(fā)明分子標(biāo)記在甜瓜生產(chǎn)實踐及育種中具有重要的價值。

17、4、本發(fā)明操作方法簡單，穩(wěn)定性強(qiáng)，為甜瓜分子育種提供了新方法。

技術(shù)特征：

1.甜瓜葉色黃化性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記site1888，其特征在于：所述分子標(biāo)記site1888的引物序列為：

2.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記site1888在苗期鑒定甜瓜植株后代出現(xiàn)葉色黃化突變體的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記site1888在苗期鑒定甜瓜植株后代出現(xiàn)葉色黃化突變體的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用為：將該分子標(biāo)記在若干個甜瓜自然群體幼苗期進(jìn)行早期預(yù)測，用待選材料dna為模板，分子標(biāo)記site1888的引物對其進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并結(jié)合田間性狀分析。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子標(biāo)記site1888在苗期鑒定甜瓜植株后代出現(xiàn)葉色黃化突變體的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用為：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分子標(biāo)記site1888在苗期鑒定甜瓜植株后代出現(xiàn)葉色黃化突變體的應(yīng)用，其特征在于：步驟(1)中，pcr擴(kuò)增體系為10μl：包括site1888f?1μl、site1888r1μl、taq?master?mix?3μl、dna模板1μl、ddh2o?4μl。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分子標(biāo)記site1888在苗期鑒定甜瓜植株后代出現(xiàn)葉色黃化突變體的應(yīng)用，其特征在于：步驟(1)中，pcr擴(kuò)增程序：在95℃下預(yù)變性5min，在95℃變性30s，在55℃退火30s，在72℃延伸45s，(95℃變性30s，在55℃退火30s，72℃延伸45s重復(fù)35個循環(huán))，72℃延伸10min，4℃保存。

技術(shù)總結(jié)
甜瓜葉色黃化性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記Site1888及其應(yīng)用，屬于植物分子遺傳育種研究領(lǐng)域。將該分子標(biāo)記在若干個甜瓜自然群體中進(jìn)行葉色黃化性狀檢測，用待選材料DNA為模板，分子標(biāo)記Site1888的引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并結(jié)合田間性狀分析，分子標(biāo)記苗期鑒定準(zhǔn)確率為100％。本發(fā)明分子標(biāo)記在甜瓜生產(chǎn)實踐、育種中具有非常重要的價值。操作方法簡便，穩(wěn)定性高，快速且準(zhǔn)確，為甜瓜分子育種提供了輔助選擇的新方法。

技術(shù)研發(fā)人員：盛云燕,薩日娜,陳可欣,王迪,紀(jì)鵬,王嶺,付麗婷,張帆
受保護(hù)的技術(shù)使用者：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10