本發(fā)明屬于發(fā)酵，特別是涉及一種利用枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素b2的培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

1、維生素b2(vb2)，又叫核黃素，化學(xué)名：7，8-二甲基-10(1，-d-核糖醇基)-異咯嗪。vb2為人體和動(dòng)物體內(nèi)黃酶類(lèi)輔基的組成部分(黃酶在生物氧化還原中發(fā)揮遞氫作用)，是生物生命活動(dòng)中不可缺少的維生素之一，與碳水化合物、脂肪及氨基酸代謝有著密切的關(guān)系，對(duì)生物生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用。人和動(dòng)物體內(nèi)不能合成vb2，必須由食物供給。當(dāng)缺乏vb2時(shí)，就影響機(jī)體的生物氧化，使代謝發(fā)生障礙，會(huì)產(chǎn)生多種疾病,例如心血管病、口角炎、偏頭痛、心絞痛、白內(nèi)障、瘧疾等，故本品可用于上述疾病的防治。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外用于抗衰老和保健的多維制劑中都含有vb2，這類(lèi)藥物不僅限于治病也用于保健，提高機(jī)體的抗病能力和延年益壽。vb2還可作飼料添加劑及化妝品等。

2、vb2化學(xué)式:c17h20n4o6，分子量：376.37

3、結(jié)構(gòu)式(氧化態(tài))：

4、

5、目前維生素b2的工業(yè)化生產(chǎn)主要包括微生物發(fā)酵法和化學(xué)半合成法兩種。

6、半合成生產(chǎn)法系微生物發(fā)酵法生產(chǎn)出d-核糖，再以d-核糖為原料通過(guò)合成法生產(chǎn)維生素b2；微生物發(fā)酵法又分為傳統(tǒng)的酵母菌發(fā)酵法和新型的基因工程菌發(fā)酵法，酵母發(fā)酵法采用菌種主要包括棉囊阿舒氏酵母(a?shbya?gossyp?ii)、阿舒氏假囊酵母(eremothecium?ashbyii)。

7、微生物發(fā)酵法以生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、原料廉價(jià)、環(huán)境友好，以及資源可再生等優(yōu)點(diǎn)，成為工業(yè)化生產(chǎn)主流。

8、酵母菌發(fā)酵法生產(chǎn)維生素b2，雖然發(fā)酵周期長(zhǎng)(6～7天)，發(fā)酵單位較低(5～6克/升)，生產(chǎn)效率低于半合成法。但因其具有經(jīng)濟(jì)有效的生產(chǎn)工藝、易于自動(dòng)化控制、產(chǎn)品無(wú)毒、純度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于核黃素的工業(yè)生產(chǎn)。

9、隨著生命科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，從九十年代以來(lái)，出現(xiàn)了一種利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素b2的新方法，即運(yùn)用dna重組技術(shù)構(gòu)建出能夠過(guò)量合成維生素b2的基因工程菌?；蚬こ叹陌l(fā)酵周期短(2～3天)，發(fā)酵單位高(10克/升以上)，它既有酵母菌發(fā)酵法產(chǎn)品質(zhì)量好的特點(diǎn)，又有化學(xué)半合成法生產(chǎn)效率高的優(yōu)勢(shì)，代表了維生素b2生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展方向，其中，以枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)為受體菌的基因工程菌，工藝比較成熟，已普遍用于維生素b2的工業(yè)化生產(chǎn)。

10、目前，國(guó)內(nèi)采用基因工程菌發(fā)酵法，存在的主要問(wèn)題有以下幾點(diǎn)：

11、1)為抑制雜菌生長(zhǎng)，利用枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素b2發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)常添加少量抗生素,易使枯草芽孢桿菌工程菌產(chǎn)生抗性基因，或者攜帶未知突變基因，發(fā)酵液菌渣處理不當(dāng)時(shí),易使環(huán)境微生物產(chǎn)生抗藥性，對(duì)生態(tài)環(huán)境及人類(lèi)健康會(huì)造成有害影響。

12、2)枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源以葡萄糖為主，易形成高濃度葡萄糖液，易使枯草芽孢桿菌工程菌產(chǎn)生溢流代謝，對(duì)維生素b2產(chǎn)素代謝造成阻遏，影響維生素b2發(fā)酵水平，降低維生素b2發(fā)酵產(chǎn)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的就在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種有效提高發(fā)酵生物量，增強(qiáng)酶活力，降低生產(chǎn)成本的利用枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素b2的培養(yǎng)基。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案為：

3、一種利用枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素b2的培養(yǎng)基，其特征在于包括一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其中

4、所述一級(jí)種子培養(yǎng)基組成為：玉米漿(折干粉)10～30g/l、酵母粉3～6g/l、雙糖6～8g/l、(nh4)2so4?5～10g/l、硫酸鎂0.3-1g/l、輕質(zhì)碳酸鈣6～9g/l、磷酸氫二鉀1～3g/l；

5、所述二級(jí)種子培養(yǎng)基組成為：玉米漿(折干粉)10～30g/l、酵母粉6～8g/l、雙糖6～8g/l、(nh4)2so4?5～10g/l、硫酸鎂0.3-1g/l、輕質(zhì)碳酸鈣6～9g/l、磷酸氫二鉀1～3g/l；

6、所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：玉米漿(折干粉)30～50g/l、酵母粉6～8g/l、甜菜堿0.5～1.5g/l、雙糖6～8g/l、(nh4)2so4?5～10g/l、硫酸鎂0.3-1g/l、輕質(zhì)碳酸鈣6～9g/l、磷酸氫二鉀1～3g/l、聚醚改性硅0.08～0.12g/l；

7、其中：所述一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基組成還包括山梨醇或異山梨醇。

8、本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述雙糖選自蔗糖、乳糖、麥芽糖中的一種；

9、優(yōu)選地，所述雙糖選自麥芽糖。

10、本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述山梨醇或異山梨醇的重量百分比為1～5g/l；

11、優(yōu)選地，所述所述山梨醇或異山梨醇的重量百分比為2～4g/l；

12、更優(yōu)選地，所述所述山梨醇或異山梨醇的重量百分比為3g/l。

13、本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述一級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為：氨基氮100～150mg/100ml、總糖3.0～5.0g/100ml、ph6.5～7.5。

14、本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述二級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為：氨基氮110～150mg/100ml、總糖3.0～5.0g/100ml、ph6.5～7.5。

15、本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為：氨基氮150～300mg/100ml、總糖2.0～3.6g/100ml、ph6.8～7.5。

16、本發(fā)明取得了如下的至少一項(xiàng)的有益效果：

17、1、本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中使用了雙糖替代葡萄糖，避免高濃度糖對(duì)代謝產(chǎn)物阻遏作用，比傳統(tǒng)工藝提高發(fā)酵單位11％以上。

18、2、本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中使用了山梨醇或異山梨醇替代抗生素，具有抑菌作用，能抑制雜菌生長(zhǎng)，但山梨醇或異山梨醇毒性低，不會(huì)引起枯草芽孢桿菌工程菌基因突變，有利于生態(tài)環(huán)境安全和人類(lèi)健康；山梨醇可提高枯草芽孢桿菌工程菌細(xì)胞膜滲透壓，使其細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物維生素b2迅速滲漏到細(xì)胞外。解除末端產(chǎn)物反饋抑制作用，提高發(fā)酵產(chǎn)物維生素b2的產(chǎn)量。

19、3、本發(fā)明確認(rèn)了利用枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素b2的一級(jí)種子、二級(jí)種子、發(fā)酵罐培養(yǎng)基的碳源、氮源最佳配伍比例，菌種生長(zhǎng)代謝環(huán)境穩(wěn)定，有利發(fā)酵產(chǎn)量、質(zhì)量穩(wěn)定。

技術(shù)特征：

1.一種利用枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素b2的培養(yǎng)基，包括一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其中

2.按照權(quán)利要求1所述的利用枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素b2的培養(yǎng)基，其中所述山梨醇或異山梨醇的重量百分比為1～5g/l。

3.按照權(quán)利要求2所述的利用枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素b2的培養(yǎng)基，其中所述山梨醇或異山梨醇的重量百分比為2～4g/l。

4.按照權(quán)利要求3所述的利用枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素b2的培養(yǎng)基，其中所述山梨醇或異山梨醇的重量百分比為3g/l。

5.按照權(quán)利要求1所述的利用枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素b2的培養(yǎng)基，其中所述一級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為：氨基氮100～150mg/100ml、總糖3.0～5.0g/100ml、ph6.5～7.5。

6.按照權(quán)利要求1所述的利用枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素b2的培養(yǎng)基，其中所述二級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為：氨基氮110～150mg/100ml、總糖3.0～5.0g/100ml、ph6.5～7.5。

7.按照權(quán)利要求1所述的利用枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素b2的培養(yǎng)基，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為：氨基氮150～300mg/100ml、總糖2.0～3.6g/100ml、ph6.8～7.5。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種利用枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B2的培養(yǎng)基，包括一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中使用了雙糖替代葡萄糖，避免高濃度糖對(duì)代謝產(chǎn)物阻遏作用；該培養(yǎng)基中使用了山梨醇替代抗生素，具有抑菌作用，但不會(huì)引起枯草芽孢桿菌工程菌基因突變，有利于生態(tài)環(huán)境安全和人類(lèi)健康；山梨醇可提高枯草芽孢桿菌工程菌細(xì)胞膜滲透壓，使其細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物維生素B2迅速滲漏到細(xì)胞外，解除末端產(chǎn)物反饋抑制作用，提高發(fā)酵產(chǎn)物維生素B2的產(chǎn)量。采用本發(fā)明的培養(yǎng)基平均發(fā)酵效價(jià)達(dá)到35.7g/L，同傳統(tǒng)技術(shù)相比，發(fā)酵水平提高11％以上。

技術(shù)研發(fā)人員：裴立忠,戶(hù)鵬東,沈毅,高宏偉,馬芳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：寧夏金維制藥股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19