本發(fā)明涉及微生物工程，具體涉及一種拜氏梭菌耐氧突變菌株及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、生物丁醇因其優(yōu)良的燃料特性，成為繼生物乙醇之后，備受關(guān)注的一種新型可再生清潔生物質(zhì)能源。生物丁醇主要的工業(yè)化生產(chǎn)方式是厭氧梭菌abe發(fā)酵(acetonebutanol?and?ethanol?fermentation)，但相對(duì)石油化工法來源的丁醇，生物丁醇因存在產(chǎn)量、生產(chǎn)效率、原料轉(zhuǎn)化率較低，導(dǎo)致的生產(chǎn)成本較高問題，使得其市場(chǎng)競(jìng)力不足。其中，o2和活性氧(reactive?oxygen?species，ros)對(duì)厭氧梭菌氧化還原代謝的致死性損傷，導(dǎo)致厭氧梭菌只能在絕對(duì)厭氧的環(huán)境生長(zhǎng)，這是“工業(yè)菌株遺傳改良”和“abe發(fā)酵生產(chǎn)”成本增加的重要因素。

2、丙酮丁醇梭菌(clostridium?acetobutylicum)atcc?824和拜氏梭菌(clostridium?beijerinckii)ncimb?8052是當(dāng)前用于abe發(fā)酵最主要的兩株工業(yè)菌種。但前者所有與產(chǎn)丁醇相關(guān)的遺傳信息都位于其染色體外的兆質(zhì)粒psol1上，容易在傳代過程中因質(zhì)粒丟失導(dǎo)致產(chǎn)丁醇性能退化；且前者含有cac824i二型限制修飾系統(tǒng)，遺傳操作時(shí)需對(duì)外源dna進(jìn)行甲基化修飾，步驟繁瑣。而后者拜氏梭菌ncimb?8052無(wú)以上兩個(gè)缺點(diǎn)，具有更好的遺傳穩(wěn)定性和遺傳可操作性。通過遺傳改造優(yōu)化產(chǎn)溶劑梭菌abe發(fā)酵性能，一直是降低生物丁醇生產(chǎn)成本的重要課題。

3、dong?et?al.(2011)研究發(fā)現(xiàn)，perr(peroxide?repressor)蛋白是調(diào)控丙酮丁醇梭菌atcc?824清除o2和ros氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)功能基因的關(guān)鍵抑制子，敲除atcc?824中perr編碼基因ca_c2634后，丙酮丁醇梭菌對(duì)氧的耐受性顯著增強(qiáng)。而目前尚未有對(duì)于拜氏梭菌的相關(guān)研究報(bào)道?；谏鲜霰尘?，開發(fā)拜氏梭菌的耐氧突變菌株具有現(xiàn)實(shí)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述需求，本發(fā)明目的在于提供一種拜氏梭菌的耐氧突變菌株、及其制備方法及應(yīng)用，本發(fā)明提供的拜氏梭菌是產(chǎn)溶劑性能顯著提高的兼性厭氧突變株，不但能在厭氧條件生長(zhǎng)，也能在有氧的空氣中良好生長(zhǎng)。

2、本發(fā)明首先提供了一種拜氏梭菌耐氧突變菌株，突變株為拜氏梭菌的perr蛋白編碼基因cbei_1336缺失或失活的突變。

3、在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的拜氏梭菌耐氧突變菌株，其以拜氏梭菌ncimb?8052產(chǎn)溶劑退化株為基礎(chǔ)菌株，通過基因工程手段阻斷perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達(dá)，進(jìn)而所得菌株；優(yōu)選地，所述阻斷其perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達(dá)的手段為crispr/cas9基因同框缺失、crispr/cas12a基因同框缺失、clostron二型內(nèi)含子插入的基因失活或同源重組等的基因編輯技術(shù)。

4、本發(fā)明還提供了一種拜氏梭菌耐氧突變菌株的構(gòu)建方法，其包括：以拜氏梭菌為出發(fā)菌株，通過基因工程手段阻斷perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達(dá)，進(jìn)而所得菌株；優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)菌株為拜氏梭菌ncimb?8052產(chǎn)溶劑退化株。

5、在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述阻斷其perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達(dá)的手段優(yōu)選為crispr/cas9基因同框缺失、crispr/cas12a基因同框缺失、clostron二型內(nèi)含子插入的基因失活或同源重組等基因編輯技術(shù)；優(yōu)選為clostron二型內(nèi)含子定點(diǎn)插入的基因失活。

6、在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中，所述通過二型內(nèi)含子插入的基因失活是通過包括下述步驟的方法實(shí)現(xiàn)的：

7、1)構(gòu)建含有特異性clostron二型內(nèi)含子片段的敲除載體；

8、2)將敲除載體轉(zhuǎn)化入拜氏梭菌目標(biāo)菌株中；

9、3)傳代、篩選和鑒定，獲得拜氏梭菌耐氧突變菌株。

10、在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟1)中所述敲除載體是通過包括下述步驟的方法構(gòu)建的：

11、a)以intron?pcr?template為模板，以ibs、ebs1d、ebs2和ebs?universal為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到特異片段；

12、所述ibs的核苷酸序列為seq?id?no:1；ebs1d的核苷酸序列為seq?id?no:2；ebs2的核苷酸序列為seq?id?no:3；ebs?universal的核苷酸序列為seq?id?no:4；

13、b)利用限制性內(nèi)切酶hindiii和bsrgi雙酶切消化所述特異片段和敲除穿梭質(zhì)粒；優(yōu)選地，所述穿梭質(zhì)粒為pmtl007；

14、c)以t4連接酶連接消化后的片段和質(zhì)粒，得到敲除載體。

15、本發(fā)明的另一方面，提供了一種敲除載體，其包含特異性clostron二型內(nèi)含子片段和穿梭質(zhì)粒；所述特異性clostron二型內(nèi)含子片段以intron?pcr?template為模板，以ibs、ebs1d、ebs2和ebs?universal為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到的；其中，所述ibs的核苷酸序列為seq?id?no:1；ebs1d的核苷酸序列為seq?id?no:2；ebs2的核苷酸序列為seq?id?no:3；ebs?universal的核苷酸序列為seq?id?no:4。

16、在根據(jù)本發(fā)明的再一方面中，本發(fā)明還提供了上述的拜氏梭菌耐氧突變菌株，或根據(jù)上述的構(gòu)建方法獲得的拜氏梭菌耐氧突變菌株在生產(chǎn)生物丁醇中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明另外還提供了一種生產(chǎn)生物丁醇的方法，其利用權(quán)利要求上述拜氏梭菌耐氧突變菌株,或根據(jù)上述的構(gòu)建方法獲得的拜氏梭菌耐氧突變菌株在生物丁醇生產(chǎn)設(shè)備中進(jìn)行厭氧發(fā)酵。

18、本發(fā)明的上述技術(shù)方案的有益效果如下：

19、1、本發(fā)明提供的方法通過二型內(nèi)含子定點(diǎn)插入法敲除了拜氏梭菌的perr蛋白編碼基因，能夠穩(wěn)定地獲得表達(dá)缺失型突變菌株；

20、2、本發(fā)明提供的拜氏梭菌突變株不但能在厭氧條件生長(zhǎng)，也能在有氧的空氣中生長(zhǎng)良好；

21、3、本發(fā)明提供的拜氏梭菌突變株具有優(yōu)良的耐氧性，且產(chǎn)溶劑丁醇和丙酮性能顯著提高，且發(fā)酵周期縮短了24小時(shí)。

技術(shù)特征：

1.一種拜氏梭菌耐氧突變菌株，突變株為拜氏梭菌的perr蛋白編碼基因cbei_1336因定點(diǎn)插入失活的突變。

2.如權(quán)利要求1所述的拜氏梭菌耐氧突變菌株，其以拜氏梭菌ncimb?8052產(chǎn)溶劑退化株為基礎(chǔ)菌株，通過基因工程手段阻斷perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達(dá)，進(jìn)而所得菌株；優(yōu)選地，所述阻斷其perr蛋白編碼基因采用clostron二型內(nèi)含子定點(diǎn)插入的基因失活的基因編輯技術(shù)。

3.如權(quán)利要求1或2所述的拜氏梭菌耐氧突變菌株，所述阻斷其perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達(dá)的手段為clostron二型內(nèi)含子定點(diǎn)插入的基因失活的基因編輯技術(shù)。

4.一種拜氏梭菌耐氧突變菌株的構(gòu)建方法，其包括：以拜氏梭菌為基礎(chǔ)菌株，通過基因工程手段阻斷perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達(dá)，進(jìn)而所得菌株；優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)菌株為拜氏梭菌ncimb?8052產(chǎn)溶劑退化株。

5.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其中，所述阻斷其perr蛋白編碼基因cbei_1336的表達(dá)的手段為clostron二型內(nèi)含子插入的基因失活的基因編輯技術(shù)；優(yōu)選為clostron二型內(nèi)含子定點(diǎn)插入的基因失活。

6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其中，所述通過二型內(nèi)含子定點(diǎn)插入的基因失活是通過包括下述步驟的方法實(shí)現(xiàn)的：

7.如權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其中，步驟1)中所述敲除載體是通過包括下述步驟的方法構(gòu)建的：

8.一種敲除載體，其特征在于，包含特異性clostron二型內(nèi)含子片段和穿梭質(zhì)粒；所述特異性clostron二型內(nèi)含子片段以intron?pcr?template為模板，以ibs、ebs1d、ebs2和ebsuniversal為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到的；其中，所述ibs的核苷酸序列為seq?id?no:1；ebs1d的核苷酸序列為seq?id?no:2；ebs2的核苷酸序列為seq?id?no:3；ebs?universal的核苷酸序列為seq?id?no:4。

9.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的拜氏梭菌耐氧突變菌株，或根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法獲得的拜氏梭菌耐氧突變菌株在生產(chǎn)生物丁醇中的應(yīng)用。

10.一種生產(chǎn)生物丁醇的方法，其特征在于：利用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述拜氏梭菌耐氧突變菌株,或根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法獲得的拜氏梭菌耐氧突變菌株在生物丁醇生產(chǎn)設(shè)備中進(jìn)行厭氧發(fā)酵。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種拜氏梭菌耐氧突變菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明提供了拜氏梭菌突變菌株為PerR蛋白編碼基因Cbei_1336因定點(diǎn)插入而失活的突變體。該突變菌株不但能在厭氧條件生長(zhǎng)，也能在有氧的空氣中良好生長(zhǎng)，耐氧且產(chǎn)溶劑丁醇和丙酮性能顯著提高，且發(fā)酵周期縮短了24小時(shí)。

技術(shù)研發(fā)人員：肖川,饒賢才,豆建雄
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19