本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)，具體涉及一種檢測(cè)牛腹瀉病毒bvdv1的試劑盒及應(yīng)用和非疾病診斷目的的可視化檢測(cè)bvdv1的方法。

背景技術(shù)：

1、牛病毒性腹瀉(bvd)是由牛病毒性腹瀉病毒(bvdv)引起的一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的傳染病。bvdv感染的情況常爆發(fā)于冬天與春天的季節(jié)交替時(shí)刻，不同年齡段的牛均可被感染，12至24月齡的牛更為易感，被感染的牛常出現(xiàn)高燒、食欲不振、眼鼻分泌物增加、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)敗血癥甚至是肺炎。在感染期牛的抵抗力變?nèi)?，免疫力急速降低，此時(shí)其他病原也會(huì)進(jìn)入牛體內(nèi)，隨后出現(xiàn)繼發(fā)性及合并性的交叉感染，如口蹄疫、布病等疫苗免疫失敗及其他病毒或細(xì)菌的繼發(fā)感染。bvdv的傳播有直接接觸傳播和間接接觸傳播，且其感染引起的免疫抑制是導(dǎo)致牛群不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。而對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng)來說，bvdv的防范重點(diǎn)是持續(xù)感染(persistent?infection，pi)牛，由于pi牛終生攜帶病毒，且病毒會(huì)隨其分泌物或排泄物排出，但在牛體內(nèi)卻不產(chǎn)生bvdv抗體，所以準(zhǔn)確的鑒定及分辨pi牛尤為重要。

2、因此，現(xiàn)有技術(shù)中，申請(qǐng)?zhí)?02410181708.5的中國發(fā)明專利公開了一種基于crispr-cas12a的bvdv特異crrna及其相關(guān)試劑盒與檢測(cè)方法，試劑盒包括bvdv特異crrna，bvdv?5'utr基因等溫?cái)U(kuò)增試劑、ispr-cas12a蛋白酶，ssdna報(bào)告系統(tǒng)，核酸酶抑制劑和nebuffer?3.1，其中bvdv特異crrna為seq?id?no.1、seq?id?no.3、seq?id?no.4和seq?idno.5所示的crrna等比例混合。本發(fā)明技術(shù)能夠在30分鐘內(nèi)檢測(cè)低至10個(gè)拷貝載量的病毒，并識(shí)別bvdv-1和bvdv-2亞型病毒。然而，bvdv基因差異很大，最為保守的基因?yàn)?′utr，因而依據(jù)非翻譯區(qū)的保守情況將bvdv主要分為兩個(gè)類型：bvdv-1(pestivirusa)、bvdv-2(pestivirus?b)，其中bvdv-1最為流行，精確檢測(cè)bvdv-1對(duì)于牛病毒性腹瀉的準(zhǔn)確快速診斷、預(yù)防具有重要意義。而上述現(xiàn)有技術(shù)中，存在對(duì)bvdv-1的檢測(cè)特異性不夠強(qiáng)，靈敏度也需進(jìn)一步提高的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，本申請(qǐng)公開了一種檢測(cè)牛腹瀉病毒bvdv1的試劑盒及應(yīng)用和非疾病診斷目的的可視化檢測(cè)bvdv1的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)bvdv1的檢測(cè)特異性不夠強(qiáng)，靈敏度也需進(jìn)一步提高的技術(shù)問題。

2、本申請(qǐng)解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

3、一種檢測(cè)牛腹瀉病毒bvdv1的試劑盒，所述試劑盒內(nèi)包括擴(kuò)增引物f1、r2，及bvdv特異crrna；

4、其中所述擴(kuò)增引物序列為：

5、f1：5'-ccctgagtacagrgyagtcgtcagtggttcgac-3'，

6、r2：5'-gatcaactccatgtgccatgtacagcagag-3'；

7、所述bvdv特異crrna序列為：

8、5'-ggguaauuucuacuaaguguagauggcaugcccucguccacgug-3'。

9、優(yōu)選地，上述檢測(cè)牛腹瀉病毒bvdv1的試劑盒，所述試劑盒中還含有l(wèi)bcas12a蛋白酶、ssdna報(bào)告系統(tǒng)、切割緩沖液。

10、優(yōu)選地，上述檢測(cè)牛腹瀉病毒bvdv1的試劑盒，所述切割緩沖液包括：10mm?tris-hcl、50mm?nacl、10mm?mgcl2以及重組白蛋白。

11、上述試劑盒在非疾病診斷目的的bvdv1可視化檢測(cè)中的應(yīng)用。

12、一種非疾病診斷目的的可視化檢測(cè)bvdv1的方法，其特征在于，采用上述試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，包括如下步驟：

13、s1.提取待檢樣本中病毒的rna；

14、s2.將s1獲得的所述rna和所述擴(kuò)增引物f1、r2加入到逆轉(zhuǎn)錄-重組酶聚合酶擴(kuò)增體系中進(jìn)行擴(kuò)增，獲得特異性產(chǎn)物；

15、s3.將s2獲得的所述特異性產(chǎn)物加入crispr-cas12a檢測(cè)體系中，對(duì)所述特異性產(chǎn)物進(jìn)行識(shí)別切割；

16、s4.利用熒光酶標(biāo)儀或熒光燈肉眼直接檢測(cè)判讀待測(cè)樣品中是否存在bvdv1特異性核酸。

17、優(yōu)選地，上述非疾病診斷目的的可視化檢測(cè)bvdv1的方法步驟s3中，所述crispr-cas12a檢測(cè)體系為30μl，包含：10×切割緩沖液3μl、1μm?lbcas12a蛋白酶1μl、1μm?crrna1.5μl、10μm?ssdna報(bào)告系統(tǒng)1.2μl、rpa擴(kuò)增產(chǎn)物5μl、depc?h2o?18.3μl。

18、優(yōu)選地，上述非疾病診斷目的的可視化檢測(cè)bvdv1的方法，步驟s3中，檢測(cè)條件為：40℃，每1min收集一次熒光，30min。

19、采用本申請(qǐng)方案至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

20、本發(fā)明采用兩步法引物篩選，篩選出引物f1、r2與crrna3組合檢測(cè)性能最好，本申請(qǐng)方案的檢測(cè)方法能夠在30分鐘內(nèi)檢測(cè)低至10個(gè)拷貝載量的bvdv1病毒，檢出率100％，并且不與其他共感染病原體發(fā)生交叉反應(yīng)，具有高靈敏度和強(qiáng)特異性。本發(fā)明中對(duì)200個(gè)臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)，準(zhǔn)確率達(dá)到100％。本發(fā)明所述的試劑盒使用簡(jiǎn)單，檢測(cè)方便快速，且靈敏度高、特異性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果可視化，直觀清楚，有利于推廣應(yīng)用。

技術(shù)特征：

1.一種檢測(cè)牛腹瀉病毒bvdv1的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內(nèi)包括擴(kuò)增引物f1、r2，及bvdv特異crrna；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)牛腹瀉病毒bvdv1的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還含有l(wèi)bcas12a蛋白酶、ssdna報(bào)告系統(tǒng)、切割緩沖液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)牛腹瀉病毒bvdv1的試劑盒，其特征在于，所述切割緩沖液包括：10mm?tris-hcl、50mm?nacl、10mm?mgcl2以及重組白蛋白。

4.權(quán)利要求1至3任一所述試劑盒在非疾病診斷目的的bvdv1可視化檢測(cè)中的應(yīng)用。

5.一種非疾病診斷目的的可視化檢測(cè)bvdv1的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，包括如下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的非疾病診斷目的的可視化檢測(cè)bvdv1的方法，其特征在于，步驟s3中，所述crispr-cas12a檢測(cè)體系為30μl，包含：10×切割緩沖液3μl、1μm?lbcas12a蛋白酶1μl、1μm?crrna?1.5μl、10μm?ssdna報(bào)告系統(tǒng)1.2μl、rpa擴(kuò)增產(chǎn)物5μl、depc?h2o?18.3μl。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的非疾病診斷目的的可視化檢測(cè)bvdv1的方法，其特征在于，步驟s3中，檢測(cè)條件為：40℃，每1min收集一次熒光，30min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)牛腹瀉病毒BVDV1的試劑盒及應(yīng)用和非疾病診斷目的的可視化檢測(cè)BVDV1的方法。本發(fā)明采用兩步法引物篩選，篩選出引物F1、R2與crRNA3組合檢測(cè)性能最好，本申請(qǐng)方案的檢測(cè)方法能夠在30分鐘內(nèi)檢測(cè)低至10個(gè)拷貝載量的BVDV1病毒，檢出率100%，并且不與其他共感染病原體發(fā)生交叉反應(yīng)，具有高靈敏度和強(qiáng)特異性。本發(fā)明所述的試劑盒使用簡(jiǎn)單，檢測(cè)方便快速，且靈敏度高、特異性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果可視化，直觀清楚，有利于推廣應(yīng)用。

技術(shù)研發(fā)人員：于有利,王建東,于正青,宣小龍,郭亞男,翟少倫,劉偉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所（寧夏草畜工程技術(shù)研究中心）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/26