本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種富含c-di-gmp的細菌質(zhì)膜囊泡及其制備方法和應用。

背景技術(shù)：

1、公開該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

2、隨著免疫腫瘤學領(lǐng)域的成熟和臨床評估的趨勢越來越多，我們對腫瘤-免疫細胞相互作用復雜性的認識越來越深。雖然免疫療法已成為許多癌癥的標準治療，但仍有55-87%的患者對檢查點抑制劑無反應。為提高反應率，人們對開發(fā)先天免疫激動劑以驅(qū)動腫瘤內(nèi)抗原呈遞細胞（apc）活化和nk/t等效應細胞激活的興趣日益濃厚，如干擾素基因刺激因子（sting）激動劑。sting激活介導多方面的?i?型干擾素（ifn-i）反應，進而促進樹突狀細胞（dc）的成熟和遷移，并引發(fā)細胞毒性?t?淋巴細胞和自然殺傷（nk）細胞進行自發(fā)免疫反應。

3、環(huán)二核苷酸（cdn）是sting的天然高親和力配體，其主要包括細菌來源的環(huán)二鳥苷酸（c-di-gmp）、環(huán)二腺苷酸（c-di-amp）、環(huán)二鳥苷腺苷酸（3，3-cgamp）以及人體來源的環(huán)二鳥苷腺苷酸（2，3-cgamp）。上述sting激動劑在臨床的應用還面臨多種問題，例如cdn的系統(tǒng)給藥的脫靶效應容易引發(fā)系統(tǒng)性免疫毒性；脫靶細胞t細胞中sting的激活，從而導致細胞凋亡并最終阻礙免疫記憶的形成。因此，有研究人員嘗試將cdn通過瘤內(nèi)給藥的方法減少這些非靶向的全身效應并提高此類方法的整體療效。然而，cdn負電荷的固有特性極大的限制了其進入細胞質(zhì)的效率。此外，cdn在體內(nèi)快速酶降解和清除進一步阻礙了其臨床應用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述cdn臨床應用過程中所面臨的問題，設(shè)計一種能夠選擇性靶向apc并保護cdn不被降解的遞送系統(tǒng)有望降低cdn的脫靶毒性、提高療效并推動cdn的臨床應用。現(xiàn)在的研究方向主要集中在開發(fā)新型cdn的遞送載體，然后對cdn進行包載得到有效的cdn遞送系統(tǒng)；本發(fā)明以c-di-gmp為例，直接利用可產(chǎn)生c-di-gmp的細菌一體化制備包載c-di-gmp的細菌質(zhì)膜囊泡，該囊泡可將c-di-gmp有效遞送至apc并激活sting。此方法可實現(xiàn)載體和c-di-gmp的同步制備，相比于傳統(tǒng)方法更簡便。

2、本發(fā)明一方面，提供一種細菌質(zhì)膜囊泡，所述細菌質(zhì)膜囊泡中含有環(huán)二鳥苷酸（c-di-gmp）。

3、進一步的，細菌質(zhì)膜囊泡中c-di-gmp含量大于等于39.9pg/mg。

4、進一步的，細菌質(zhì)膜囊泡的粒徑在50-300nm范圍內(nèi)。

5、進一步的，細菌質(zhì)膜囊泡由革蘭氏陰性大腸桿菌、沙門氏菌中獲得。

6、進一步的，細菌質(zhì)膜囊泡在菌株通過誘導劑富含c-di-gmp后獲得。

7、進一步的，誘導劑選自熊去氧膽酸、精氨酸、亞精胺中的一種或多種。

8、本發(fā)明另一方面，提供一種細菌質(zhì)膜囊泡的制備方法，步驟如下：

9、（1）采用誘導劑對細菌進行誘導培養(yǎng)，使細菌中富含c-di-gmp；

10、（2）采用溶菌酶降解外膜，獲得富含c-di-gmp的細菌原生質(zhì)體；

11、（3）微孔濾膜擠出，獲得富含c-di-gmp細菌質(zhì)膜囊泡。

12、進一步的，步驟（1）中誘導采用的誘導劑選自熊去氧膽酸、精氨酸、亞精胺中的一種或多種。

13、進一步的，步驟（3）粒徑在50-300nm范圍內(nèi)。

14、進一步的，一種細菌質(zhì)膜囊泡的制備方法，詳細步驟如下：

15、（1）將10μl?od值為1的菌液（大腸桿菌或者鼠傷寒沙門氏菌）接種至5ml?lb液體培養(yǎng)基中并添加誘導劑（l-精氨酸、熊去氧膽酸、亞精胺其中的一種或多種）。將菌液于37℃，200rpm條件下培養(yǎng)12h。在這個過程中，誘導劑刺激細菌產(chǎn)生大量c-di-gmp聚集在細菌細胞質(zhì)中。培養(yǎng)結(jié)束后，6000g離心5min收集細菌。

16、（2）將步驟（1）收集到的細菌，重懸至2?ml含有20%蔗糖、50mm?edta和2mg/ml溶菌酶的tris-hcl緩沖液（50mm，ph=8.0）中，并在37℃，100rpm條件下孵育30min。在這個過程中，溶菌酶降解具有毒性的細菌外膜。孵育結(jié)束后，6000g離心5min，棄去含有細菌外膜成分的上清液，收集細菌原生質(zhì)體沉淀。

17、（3）將步驟（2）所收集的細菌原生質(zhì)體用2ml生理鹽水重懸，隨后依次通過1μm、400nm和200nm孔徑的微孔濾膜，最終得到粒徑為50-300nm的富含c-di-gmp的細菌質(zhì)膜囊泡。在過膜擠出的過程中，細菌質(zhì)膜被打破重排形成粒徑更小的囊泡，重排時將c-di-gmp包裹進入囊泡。

18、本發(fā)明另一方面，提供一種細菌質(zhì)膜囊泡在制備激活sting通路藥物中的應用。

19、本發(fā)明另一方面，提供一種細菌質(zhì)膜囊泡在制備抗腫瘤藥物中的應用。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

21、（1）本發(fā)明通過誘導細菌大量產(chǎn)生c-di-gmp，然后在制備細菌質(zhì)膜囊泡的過程中，c-di-gmp被囊泡包載得到載c-di-gmp的細菌質(zhì)膜囊泡。本發(fā)明實現(xiàn)囊泡和c-di-gmp的同步制備，制備過程更簡單。

22、（2）該囊泡本身富含sting激動劑c-di-gmp，具有激活靶細胞sting通路的功能，無需額外添加sting激動劑。

23、（3）本發(fā)明在制備囊泡的過程中特意去除了具有毒性的細菌外膜，降低了毒性外膜成分誘導的全身炎癥水平，顯著提高了制劑的安全性。

24、（4）通過本發(fā)明制備的細菌質(zhì)膜囊泡除了具有sting激活的能力外，細菌來源的質(zhì)膜囊泡還具有激活tlr的能力，與c-di-gmp協(xié)同激活apc，顯著提高了c-di-gmp的apc活化能力和最終的抗腫瘤效果。

25、（5）本發(fā)明利用細菌來源的質(zhì)膜囊泡作為c-di-gmp遞送的載體，可主動靶向apc，降低脫靶毒性并提高安全性。

26、（6）本發(fā)明通過添加低成本的單一組分就能獲得大量具有sting激活能力的制劑，相較于傳統(tǒng)的sting激動劑的獲得顯著降低了成本。

技術(shù)特征：

1.一種細菌質(zhì)膜囊泡，其特征是，所述細菌質(zhì)膜囊泡中含有環(huán)二鳥苷酸。

2.如權(quán)利要求1所述的細菌質(zhì)膜囊泡，其特征是，所述細菌質(zhì)膜囊泡中環(huán)二鳥苷酸含量大于等于39.9pg/mg。

3.如權(quán)利要求1所述的細菌質(zhì)膜囊泡，其特征是，所述細菌質(zhì)膜囊泡的粒徑在50-300nm范圍內(nèi)。

4.如權(quán)利要求1所述的細菌質(zhì)膜囊泡，其特征是，所述細菌質(zhì)膜囊泡由革蘭氏陰性大腸桿菌、沙門氏菌中獲得。

5.如權(quán)利要求1所述的細菌質(zhì)膜囊泡，其特征是，所述細菌質(zhì)膜囊泡在菌株通過誘導劑富含環(huán)環(huán)二鳥苷酸后獲得。

6.如權(quán)利要求1所述細菌質(zhì)膜囊泡的制備方法，其特征是，步驟如下：

7.如權(quán)利要求6所述的細菌質(zhì)膜囊泡的制備方法，其特征是，步驟（1）中誘導采用的誘導劑選自熊去氧膽酸、精氨酸、亞精胺中的一種或多種。

8.如權(quán)利要求6所述的細菌質(zhì)膜囊泡的制備方法，其特征是，步驟（3）粒徑在50-300nm范圍內(nèi)。

9.如權(quán)利要求1所述的細菌質(zhì)膜囊泡在制備激活sting通路藥物中的應用。

10.如權(quán)利要求1所述的細菌質(zhì)膜囊泡在制備抗腫瘤藥物中的應用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種富含c?di?GMP的細菌質(zhì)膜囊泡及其制備方法和應用，本發(fā)明直接利用可產(chǎn)生c?di?GMP的細菌一體化制備包載c?di?GMP的細菌質(zhì)膜囊泡，該囊泡可將c?di?GMP有效遞送至APC并激活STING。此方法可實現(xiàn)載體和c?di?GMP的同步制備，相比于傳統(tǒng)方法更簡便。通過小鼠實驗確認本發(fā)明所述的囊泡具有抗腫瘤效果。

技術(shù)研發(fā)人員：劉永軍,袁詩俊,張娜
受保護的技術(shù)使用者：山東大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19