本發(fā)明涉及生物催化，具體涉及一種酶法合成d-苯甘氨酸的方法，特別涉及一種以利用腈水解活性的酶催化合成d-苯甘氨酸的方法。

背景技術(shù)：

1、d-苯甘氨酸是一種非天然氨基酸，它是合成醫(yī)藥β-內(nèi)酰胺類抗生素的重要中間體，作為氨芐青霉素、疊氮頭孢、頭孢克羅、匹夫氨芐等的重要側(cè)鏈而廣泛應(yīng)用于制藥領(lǐng)域。因為d-苯甘氨酸合成后的藥物口服和注射均可，所以在國內(nèi)外醫(yī)藥市場應(yīng)用前景廣闊。同時，它還是合成各種多肽激素、多種農(nóng)藥的重要中間體。因此，開發(fā)綠色、高效的d-苯甘氨酸合成技術(shù)成為國內(nèi)外重要的研究目的。

2、目前，d-苯甘氨酸的制備技術(shù)主要包括化學(xué)合成法和生物法。化學(xué)合成法雖比較成熟，但此方法制備過程中需要高溫高壓、強酸強堿等極端條件，對操作人員要求較高且會產(chǎn)生不利于環(huán)境的有毒物質(zhì)。而生物催化合成d-苯甘氨酸具有反應(yīng)條件溫和、步驟簡單以及可持續(xù)發(fā)展等顯著優(yōu)勢，已成為制備手性羧酸的重要方法。但國內(nèi)外關(guān)于利用腈水解酶生物催化合成d-苯甘氨酸的相關(guān)報道很少。生物催化法反應(yīng)條件溫和、催化劑特異性高、選擇性強、能耗少、催化劑制作成本低廉、工藝環(huán)境友好，產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益，因此，生物催化是綠色化學(xué)與綠色化工發(fā)展的重要趨勢之一。但是野生菌普遍存在酶活表達(dá)量低，穩(wěn)定性較差，對底物和底物的耐受性不高等缺點。隨著基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，可以通過分子改造構(gòu)建基因工程菌，提高腈水解酶的活性、穩(wěn)定性及底物耐受性等催化性能的同時提高轉(zhuǎn)化率。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種酶法合成d-苯甘氨酸的方法，通過單酶催化合成d-苯甘氨酸。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種d-苯甘氨酸的合成方法，包括以下步驟：

3、以2-苯氨基乙腈為底物，利用所述的腈水解酶進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物為d-苯甘氨酸。

4、優(yōu)選的，所述的腈水解酶來源于：熒光假單胞菌（ pseudomonas?fluorescens）、肺炎克雷伯桿菌（ klebsiella?pneumoiae）、糞產(chǎn)堿桿菌（ alcaligenes?faecalis）。

5、優(yōu)選的，來源于熒光假單胞菌的腈水解酶的氨基酸序列如seq?id?no.2所示；

6、優(yōu)選的，來源于肺炎克雷伯桿菌的腈水解酶的氨基酸序列如seq?id?no.4所示；

7、優(yōu)選的，來源于糞產(chǎn)堿桿菌的腈水解酶的氨基酸序列如seq?id?no.6所示。

8、優(yōu)選的，所述腈水解酶以粗酶液或全細(xì)胞的形式加入。

9、優(yōu)選的，所述催化反應(yīng)的溫度為20~37℃，所述催化反應(yīng)的時間為12~24h。

10、優(yōu)選的，當(dāng)所述的腈水解酶是以粗酶液的形式加入時，所述的腈水解酶在反應(yīng)體系中的濃度為30od600/ml；

11、當(dāng)所述的腈水解酶以全細(xì)胞的形式加入時，所述全細(xì)胞的濃度為30od600/ml。

12、優(yōu)選的，所述催化反應(yīng)在濃度為50~100mm，ph值為6.5~8.5的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。

13、優(yōu)選的，當(dāng)所述腈水解酶是以粗酶液或全細(xì)胞的形式加入時，所述催化體系含有2-苯氨基乙腈、磷酸水溶液和所述腈水解酶。

技術(shù)特征：

1.一種改良的腈水解酶，其特征在于，所述改良的腈水解酶的氨基酸序列如seq?idno.2、seq?id?no.4或seq?id?no.6所示。

2.權(quán)利要求1所述改良的腈水解酶的編碼基因，其特征在于，編碼所述改良的腈水解酶的核苷酸序列如seq?id?no.1、seq?id?no.3或seq?id?no.5所示。

3.一種含權(quán)利要求2所述編碼基因的重組載體。

4.一種包含權(quán)利要求2所述編碼基因并表達(dá)權(quán)利要求1所述改良的腈水解酶的重組工程細(xì)胞。

5.一種酶法合成d-苯甘氨酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：以2-苯氨基乙腈為底物，利用權(quán)利要求1所述改良的腈水解酶或權(quán)利要求4所述重組工程細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物包括d-苯甘氨酸。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，當(dāng)加入所述改良的腈水解酶時，所述改良的腈水解酶在反應(yīng)體系中的濃度為30od600/ml。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，當(dāng)加入所述重組工程細(xì)胞時，所述全細(xì)胞的濃度為30od600/ml。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述催化反應(yīng)的溫度為25-37℃，所述催化反應(yīng)的時間為12-24h。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述催化反應(yīng)在濃度為50-100mm，ph值為6.5-8.5的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種酶法合成D?苯甘氨酸的方法，涉及生物催化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先提供了改良的腈水解酶的氨基酸序列和核苷酸序列，并提供了利用這一改良的腈水解酶單酶酶法合成D?苯甘氨酸的方法，包括如下步驟：以2?苯氨基乙腈為底物，經(jīng)腈水解酶催化反應(yīng)生產(chǎn)D?苯甘氨酸，催化效率高。

技術(shù)研發(fā)人員：賈振華,李冉,李海寧,宋聰
受保護(hù)的技術(shù)使用者：河北省科學(xué)院生物研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/26