本公開(kāi)涉及化妝品原料性能篩選，具體涉及一種利用3d黑素皮膚模型篩選原料美白功效的方法。

背景技術(shù)：

1、近年來(lái)，美白類化妝品受到越來(lái)越多東方女性的青睞。在西方國(guó)家，美白產(chǎn)品還被應(yīng)用于無(wú)規(guī)律色素過(guò)度沉著的預(yù)防和治療中，如老年斑和雀斑等。因此，眾多化妝品公司在改變皮膚色素沉著方面開(kāi)展大量的研究，進(jìn)行高效美白產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)工作。作為抵御紫外線輻射的物理屏障，黑色素對(duì)皮膚具有關(guān)鍵的光保護(hù)功能，然而，黑色素過(guò)度生成會(huì)導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)色斑、膚色不均、暗沉等問(wèn)題，影響人們的皮膚美觀和自信。因此，改善色素過(guò)度沉著、美白肌膚是很多消費(fèi)者的急切需求。

2、美白類功效性護(hù)膚品的開(kāi)發(fā)中，對(duì)其活性原料的美白功效進(jìn)行評(píng)估是配方設(shè)計(jì)前期的重要步驟之一。隨著美白原料及配方的持續(xù)研發(fā)投入，應(yīng)建立令人信服的功效評(píng)價(jià)方法。體外重建人體皮膚模型已廣泛用于皮膚刺激、皮膚致敏和皮膚光毒性等研究中，而體外構(gòu)建含黑色素細(xì)胞的皮膚模型可用于美白化妝品功效評(píng)估。

3、目前，細(xì)胞層面用于美白評(píng)估的模型主要是小鼠黑色素瘤b16細(xì)胞，由于其具有多次傳代、生長(zhǎng)快以及對(duì)培養(yǎng)要求低等優(yōu)點(diǎn)，成為篩選美白活性成分的首選細(xì)胞，但b16細(xì)胞與人體黑素細(xì)胞始終存在差異，并且經(jīng)過(guò)幾代培養(yǎng)后，其黑色素產(chǎn)生能力會(huì)降低，這就導(dǎo)致篩選過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)漏檢和誤檢等問(wèn)題。

4、3d人造皮膚模型因?yàn)槠浣M織結(jié)構(gòu)和生理功能與正常皮膚組織十分相似，而成為良好的皮膚替代模型，并且在近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于化妝品原料及成品功效評(píng)估。其中，3d黑素皮膚模型將正常人的表皮細(xì)胞與黑素細(xì)胞共培養(yǎng)，采用氣液面培養(yǎng)方式構(gòu)建而成，具有類似正常人體表皮組織結(jié)構(gòu)，有助于提高篩選具有美白活性原料的準(zhǔn)確性。

5、cn115501156a中公開(kāi)了一種具有美白舒緩功效的化妝品原料組合物及其評(píng)價(jià)體系，采用3d皮膚模型功效評(píng)價(jià)模塊，用于對(duì)含原料組合物的化妝品成品進(jìn)行功效評(píng)價(jià)。但該方案僅從表觀層面來(lái)分析原料的美白功效，沒(méi)有從與黑色素相關(guān)的基因?qū)用孢M(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，也沒(méi)有建立一個(gè)詳細(xì)的評(píng)分系統(tǒng)，篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性不夠高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，本公開(kāi)的目的是從多層面評(píng)估原料的美白功效，提高原料美白功效篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本公開(kāi)提供以下技術(shù)方案：

3、一種利用3d黑素皮膚模型篩選原料美白功效的方法，包括以下步驟：

4、s1.選用3d黑素皮膚模型，分別設(shè)置空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和樣品組；

5、s2.對(duì)所述陽(yáng)性對(duì)照組和所述樣品組進(jìn)行uvb輻照，向所述陰性對(duì)照組添加曲酸并進(jìn)行uvb輻照，所述空白對(duì)照組在培養(yǎng)期間不進(jìn)行處理且避光；

6、s3.輻照結(jié)束后，向所述樣品組添加待檢測(cè)的原料樣品，繼續(xù)培養(yǎng)；

7、s4.培養(yǎng)結(jié)束后，分別檢測(cè)所述樣品組、所述空白對(duì)照組、所述陽(yáng)性對(duì)照組和所述陰性對(duì)照組的皮膚表觀亮度、黑色素含量、mitf基因表達(dá)量以及tyr基因表達(dá)量；

8、s5.根據(jù)步驟s4中的檢測(cè)結(jié)果判斷所述原料樣品的美白功效。

9、優(yōu)選地，在步驟s5中，分別計(jì)算所述樣品組、所述空白對(duì)照組和所述陰性對(duì)照組與所述陽(yáng)性對(duì)照組的皮膚表觀亮度、黑色素含量、mitf基因表達(dá)量、tyr基因表達(dá)量的比值；

10、用graphpad?prism作圖，結(jié)果表示為mean±sd；各組間比較采用one-way?anova統(tǒng)計(jì)分析，所有的統(tǒng)計(jì)分析均為雙尾；其中

11、p<0.05認(rèn)為具有顯著差異，說(shuō)明受試物具有一定美白作用，評(píng)分為0.3；

12、p<0.01認(rèn)為具有非常顯著差異，說(shuō)明受試物具有顯著美白作用，評(píng)分為0.5；

13、p<0.001認(rèn)為具有極其顯著差異，說(shuō)明受試物具有極其顯著美白作用，評(píng)分為0.7；

14、p<0.0001認(rèn)為具有極其顯著差異，說(shuō)明受試物具有極其顯著美白作用，評(píng)分為1.0；

15、匯總四個(gè)檢測(cè)指標(biāo)的評(píng)分，由此判斷所述樣品組中的所述原料樣品的美白功效強(qiáng)弱。

16、更優(yōu)選地，將所述皮膚表觀亮度和所述黑色素含量作為宏觀指標(biāo)，將所述mitf基因表達(dá)量和所述tyr基因表達(dá)量作為微觀指標(biāo)，所述樣品組至少有一個(gè)所述宏觀指標(biāo)和至少有一個(gè)所述微觀指標(biāo)的評(píng)分大于等于0.3時(shí)，判定所述樣品組中的原料樣品具有美白效果。

17、優(yōu)選地，在步驟s2中，輻照強(qiáng)度為0.2～0.4mw/cm2，輻照溫度為28℃，輻照劑量為50～70mj/cm2。

18、更優(yōu)選地，輻照天數(shù)為所述輻照劑量與所述輻照強(qiáng)度的比值。

19、優(yōu)選地，所述原料樣品的添加量為0.5～2ml，所述原料樣品的濃度為5mg/ml～10mg/ml。

20、更優(yōu)選地，連續(xù)4天重復(fù)步驟s3。

21、優(yōu)選地，還包括對(duì)所述原料樣品的溶解度進(jìn)行評(píng)估的步驟：

22、水中溶解度≥1000μg/ml的所述原料樣品直接溶于培養(yǎng)基；

23、水中溶解度<1000μg/ml的所述原料樣品用二甲基亞砜溶劑溶解。

24、優(yōu)選地，所述3d黑素皮膚模型的培養(yǎng)條件為：37±0.5℃，(5±1)％的co2濃度，飽和濕度。

25、優(yōu)選地，在步驟s4中，使用體式顯微鏡拍攝所述3d黑素皮膚模型的表觀照片，使用色差儀檢測(cè)所述皮膚表觀亮度；

26、使用堿裂解法檢測(cè)所述3d黑素皮膚模型的所述黑色素含量，通過(guò)rna轉(zhuǎn)錄和qcpr檢測(cè)所述mitf基因和tyr基因的表達(dá)。

27、本公開(kāi)要求保護(hù)的技術(shù)方案取得了以下有益效果：

28、本公開(kāi)的檢測(cè)指標(biāo)包括皮膚表觀亮度、黑色素含量以及與黑色素相關(guān)的基因表達(dá)，使得化妝品原料作用對(duì)象涵蓋了表觀和微觀兩種維度，建立了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)體系，具有準(zhǔn)確、高效的優(yōu)勢(shì)，為皮膚護(hù)理產(chǎn)品美白活性原料的前期驗(yàn)證及篩選提供快捷可靠的評(píng)價(jià)方法，為美白原料的復(fù)配方案提供參考依據(jù)，也為護(hù)膚品行業(yè)動(dòng)物替代實(shí)驗(yàn)、皮膚護(hù)理產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和功效驗(yàn)證的進(jìn)一步研究提供有效依據(jù)。

技術(shù)特征：

1.一種利用3d黑素皮膚模型篩選原料美白功效的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟s5中，分別計(jì)算所述樣品組、所述空白對(duì)照組和所述陰性對(duì)照組與所述陽(yáng)性對(duì)照組的皮膚表觀亮度、黑色素含量、mitf基因表達(dá)量、tyr基因表達(dá)量的比值；

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將所述皮膚表觀亮度和所述黑色素含量作為宏觀指標(biāo)，將所述mitf基因表達(dá)量和所述tyr基因表達(dá)量作為微觀指標(biāo)，所述樣品組至少有一個(gè)所述宏觀指標(biāo)和至少有一個(gè)所述微觀指標(biāo)的評(píng)分大于等于0.3時(shí)，判定所述樣品組中的所述原料樣品具有美白效果。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟s2中，輻照強(qiáng)度為0.2～0.4mw/cm2，輻照溫度為28℃，輻照劑量為50～70mj/cm2。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，輻照天數(shù)為所述輻照劑量與所述輻照強(qiáng)度的比值。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述原料樣品的添加量為0.5～2ml，所述原料樣品的濃度為5mg/ml～10mg/ml。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，連續(xù)4天重復(fù)步驟s3。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括對(duì)所述原料樣品的溶解度進(jìn)行評(píng)估的步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述3d黑素皮膚模型的培養(yǎng)條件為：37±0.5℃，(5±1)％的co2濃度，飽和濕度。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟s4中，使用體式顯微鏡拍攝所述3d黑素皮膚模型的表觀照片，使用色差儀檢測(cè)所述皮膚表觀亮度；

技術(shù)總結(jié)
本公開(kāi)涉及一種利用3D黑素皮膚模型篩選原料美白功效的方法，包括以下步驟：S1.選用3D黑素皮膚模型，分別設(shè)置空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和樣品組；S2.對(duì)所述陽(yáng)性對(duì)照組和所述樣品組進(jìn)行UVB輻照，向所述陰性對(duì)照組添加曲酸并進(jìn)行UVB輻照，所述空白對(duì)照組在培養(yǎng)期間不進(jìn)行處理且避光；S3.輻照結(jié)束后，向所述樣品組添加待檢測(cè)的原料樣品，繼續(xù)培養(yǎng)；S4.培養(yǎng)結(jié)束后，分別檢測(cè)所述樣品組、所述空白對(duì)照組、所述陽(yáng)性對(duì)照組和所述陰性對(duì)照組的皮膚表觀亮度、黑色素含量、MITF基因表達(dá)以及TYR基因表達(dá)；S5.根據(jù)步驟S4中的4個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果判斷所述原料樣品的美白功效。本公開(kāi)的篩選、評(píng)價(jià)指標(biāo)涵蓋了皮膚表觀和微觀兩種維度，結(jié)果更具準(zhǔn)確性。

技術(shù)研發(fā)人員：程玉瑩,王博,張超,馬驍,王飛飛,郭振宇
受保護(hù)的技術(shù)使用者：云南貝泰妮生物科技集團(tuán)股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17