本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種寬體金線蛭來源的失穩(wěn)酶融合蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、寬體金線蛭(whitmania?pigra?whitman)隸屬于無吻蛭目，黃蛭科，金線蛭屬，是中藥材水蛭的基原動(dòng)物之一，具有較大的藥用價(jià)值，在我國(guó)分布廣泛，常年棲息于水田及與其相同的溝渠中，以吸食新鮮螺類體液為生。

2、申請(qǐng)人從寬體金線蛭(w.pigra)唾液腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(srx16840326、srx16840327、srx16840328)中篩選到一種具有抑菌和溶血功效水蛭多肽的轉(zhuǎn)錄本，通過cdna序列克隆驗(yàn)證了序列的正確性。除去多肽信號(hào)肽后，基于pas方法，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)拼接引物，合成目的基因，在pet-32a載體的ncoⅰ和xhoⅰ酶切位點(diǎn)插入目的基因，構(gòu)建了pet32a-trx-ek-wpdestabilase原核表達(dá)體系。經(jīng)iptg誘導(dǎo)、破碎、純化，sds-page檢測(cè)得到n端帶有trx等標(biāo)簽的融合目的蛋白，融合目的蛋白的抗菌活性為14.17μg/ml，溶血率為44.06％；詳見中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枺篶n202111590989.2；授權(quán)公告號(hào)：cn114057866b。

3、為了進(jìn)一步提高寬體金線蛭失穩(wěn)酶(wpdestabilase)的活性，申請(qǐng)人對(duì)wpdestabilase的表達(dá)策略進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了抑菌活性和溶栓活性顯著提高的融合蛋白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、一方面，本發(fā)明提供了一種活性提高的失穩(wěn)酶融合蛋白，所述失穩(wěn)酶融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.3或seq?id?no.5所示。

2、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述失穩(wěn)酶融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。

3、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述失穩(wěn)酶融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.5所示。

4、另一方面，本發(fā)明還提供了上述失穩(wěn)酶融合蛋白的編碼基因。

5、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述失穩(wěn)酶融合蛋白的編碼基因的序列如seq?id?no.4所示。

6、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述失穩(wěn)酶融合蛋白的編碼基因的序列如seq?id?no.6所示。

7、另一方面，本發(fā)明還提供了包含上述失穩(wěn)酶融合蛋白或其編碼基因的生物材料。所述生物材料選自：包含上述失穩(wěn)酶融合蛋白或其編碼基因的載體，或者，包含上述失穩(wěn)酶融合蛋白或其編碼基因的宿主細(xì)胞。

8、另一方面，本發(fā)明還提供了包含上述編碼基因的載體，或者，包含所述載體的宿主細(xì)胞。

9、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體包括克隆載體和表達(dá)載體。

10、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體為pczn1。

11、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體是環(huán)狀的或線狀的。

12、本文所用術(shù)語(yǔ)“載體”是指設(shè)計(jì)用于在不同宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體?！氨磉_(dá)載體”是指具有外源細(xì)胞中摻入和表達(dá)異源dna片段的能力的載體。許多原核和真核表達(dá)載體可商購(gòu)獲得。選擇合適的表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。

13、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。

14、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述原核細(xì)胞來源于大腸桿菌或農(nóng)桿菌。

15、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述真核細(xì)胞為酵母。

16、另一方面，本發(fā)明還提供了上述失穩(wěn)酶融合蛋白，或者，包含上述失穩(wěn)酶融合蛋白或其編碼基因的生物材料在溶解血栓和/或抑菌中的應(yīng)用。

17、另一方面，本發(fā)明還提供了上述失穩(wěn)酶融合蛋白，或者，包含上述失穩(wěn)酶融合蛋白或其編碼基因的生物材料在制備用于溶解血栓和/或抑菌的試劑中的用途。

18、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抑菌為抑制球菌，例如，黃體微球菌。

19、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述血栓選自新鮮血栓和老化血栓(或稱之為，陳舊性血栓)中的一種或任意幾種。

20、另一方面，本發(fā)明還提供了一種制備上述失穩(wěn)酶融合蛋白的方法，所述方法包括利用表達(dá)載體對(duì)上述失穩(wěn)酶融合蛋白進(jìn)行表達(dá)的步驟。

21、進(jìn)一步的，所述方法還包括分離/純化所述失穩(wěn)酶融合蛋白的步驟。

22、本發(fā)明通過對(duì)寬體金線蛭來源的失穩(wěn)酶wpdestabilase表達(dá)策略的優(yōu)化，提高了失穩(wěn)酶融合蛋白的抑菌活性、溶栓活性和異肽酶活性，提高了wpdestabilase的應(yīng)用前景和應(yīng)用空間。

技術(shù)特征：

1.一種活性提高的失穩(wěn)酶融合蛋白，所述失穩(wěn)酶融合蛋白的氨基酸序列如seq?idno.3所示。

2.包含權(quán)利要求1所述失穩(wěn)酶融合蛋白或其編碼基因的生物材料。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料選自：包含權(quán)利要求1所述失穩(wěn)酶融合蛋白或其編碼基因的載體，或者，包含權(quán)利要求1所述失穩(wěn)酶融合蛋白或其編碼基因的宿主細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述載體包括克隆載體和表達(dá)載體。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述載體為pczn1。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。

7.權(quán)利要求1所述的失穩(wěn)酶融合蛋白或者權(quán)利要求2-6任一所述的生物材料在溶解血栓和/或抑菌中的應(yīng)用。

8.權(quán)利要求1所述的失穩(wěn)酶融合蛋白或者權(quán)利要求2-6任一所述的生物材料在制備用于溶解血栓和/或抑菌的試劑中的用途。

9.一種制備權(quán)利要求1所述的失穩(wěn)酶融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括利用表達(dá)載體對(duì)權(quán)利要求1所述的失穩(wěn)酶融合蛋白進(jìn)行表達(dá)的步驟。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法還包括分離/純化所述失穩(wěn)酶融合蛋白的步驟。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種活性提高的失穩(wěn)酶融合蛋白，所述失穩(wěn)酶融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.3或SEQ?ID?No.5所示，本發(fā)明通過對(duì)寬體金線蛭來源的失穩(wěn)酶Wpdestabilase表達(dá)策略的優(yōu)化和序列改造，提高了失穩(wěn)酶融合蛋白的抑菌活性、溶栓活性和異肽酶活性，提高了Wpdestabilase的應(yīng)用前景和應(yīng)用空間。

技術(shù)研發(fā)人員：程搏幸,劉飛,郜天一,張奎,盧昱希
受保護(hù)的技術(shù)使用者：貴州師范學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10