本發(fā)明涉及生物診斷，具體涉及一種凍干型黃顙魚杯狀病毒的熒光定量pcr技術(shù)檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

1、黃顙魚杯狀病毒（yellow?catfish?calicivirus,?yccv）全基因組長為7432bp，分類于小rna病毒目中的杯狀病毒科caliciviridae，是一種近年來新發(fā)現(xiàn)的黃顙魚病毒性疾病，病原為杯狀病毒，主要發(fā)生于春后。感染該病毒的黃顙魚會出現(xiàn)聚堆、趴邊、游水、頭朝上尾朝下、螺旋狀狂游等異常行為，以及下頜、鰓蓋和口腔基部出血，肝臟色淺，脾臟充血，腎臟腫大、壞死等病理變化，限制了魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，因此，黃顙魚杯狀病毒的檢測和鑒定對于疾病的預(yù)防和控制至關(guān)重要。

2、現(xiàn)有的黃顙魚杯狀病毒檢測方法主要包括傳統(tǒng)的病毒分離、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測等。比如在中國專利cn202110574113.2中公開了以調(diào)控病毒復(fù)制的關(guān)鍵基因即病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural?protein,ns)，設(shè)計兩條引物對該病毒進行檢測，該專利利用的方法為常規(guī)pcr方法檢測，存在操作繁瑣、檢測限高且pcr后需要開蓋進行凝膠電泳進一步確定診斷結(jié)果，容易造成交叉污染?，F(xiàn)有的檢測方法存在操作復(fù)雜、檢測周期長、靈敏度和特異性不足等問題，難以滿足養(yǎng)殖業(yè)對快速、準(zhǔn)確檢測的需求，而且都是液態(tài)試劑，保存穩(wěn)定性差，應(yīng)用范圍有限。

3、基于此，亟需開發(fā)一種快速、靈敏、特異的黃顙魚杯狀病毒檢測試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明設(shè)計了一種凍干型黃顙魚杯狀病毒的熒光定量pcr技術(shù)檢測試劑盒，具有高靈敏度、高特異性、常溫穩(wěn)定、擺脫冷鏈、即時活化、不相容試劑共存、無交叉污染等優(yōu)點。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案：

3、一方面，本發(fā)明提供了一種凍干型黃顙魚杯狀病毒的熒光定量pcr技術(shù)檢測試劑盒，所述試劑盒包括pcr?mix，陽性對照、陰性對照、復(fù)溶劑；

4、其中，所述pcr?mix為凍干試劑，包括50~500mm核苷酸序列如seq?id?no.1所示的上游引物、50~500nm核苷酸序列如seq?id?no.2所示的下游引物、25~250nm?核苷酸序列如seq?id?no.3所示的taqman熒光探針。

5、本發(fā)明制備的凍干劑型的pcr?mix在儲存運輸過程不需要進行冷鏈運輸，大大降低了試劑運輸?shù)某杀?，在運輸過程中不會出現(xiàn)試劑失效的風(fēng)險，且該凍干劑型的pcr試劑中含有尿嘧啶-dna糖基化酶防污染體系，并以dutp替代dttp作為pcr原料，在進行pcr擴增時，尿嘧啶-dna糖基化酶能消化pcr產(chǎn)物中含u的pcr產(chǎn)物，進而防止pcr產(chǎn)物氣溶膠污染，保證凍干劑型的pcr試劑檢測效果。

6、優(yōu)選地，所述pcr?mix還包括1u~10u?rnase抑制劑、體積比為1%~50%的甘油、10mm~200mm鉀離子、0.01~1mm?edta、20mm~80m且ph為7.5~8.9的tris-hcl、10mm~50mm含u的dntp、100mm~4m?kcl、1mm~50mm?mgcl2、體積比為0.01~0.3%的tween-20、體積比為0.01~0.1%的四氫噻吩1-氧化物、10mm~5m四甲基氯化銨、10mm~100mm甜菜堿、體積比為0.01~0.1%的dmso、體積比為0.01~0.3%的triton?x-100。

7、優(yōu)選地，所述pcr?mix還包括0.5~2u熱啟動taq酶、0.5~5u反轉(zhuǎn)錄酶、0.1u~10u?udg酶。

8、優(yōu)選地，所述pcr?mix還包括體積比為30.3%的凍干保護劑。

9、優(yōu)選地，所述凍干保護劑包括海藻糖1~15%、蔗糖1~15%、甘露醇1~15%、聚乙二醇0.01~0.5%、2%~10%卵磷脂和2%~10%環(huán)糊精。

10、優(yōu)選地，所述復(fù)溶劑為nuclease-free?water。

11、另一方面，本發(fā)明還提供了一種非診斷目的檢測黃顙魚杯狀病毒的方法，其特征在于，采用所述的凍干型黃顙魚杯狀病毒的熒光定量pcr技術(shù)檢測試劑盒。

12、優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：

13、s1:提取樣本核酸；

14、s2:將20μl復(fù)溶劑加入pcr?mix中，再加入5μl步驟s1提取的核酸溶液，進行pcr擴增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對檢測結(jié)果進行判定。

15、優(yōu)選地，所述pcr擴增反應(yīng)條件為：50℃?1min；95℃?2min；95℃?10s，59℃?30s，40個循環(huán)。

16、優(yōu)選地，所述結(jié)果判定為：當(dāng)ct值＜35，則結(jié)果為陽性；當(dāng)35≤ct＜37擴增曲線呈s型，可疑樣本需復(fù)檢；復(fù)檢結(jié)果一致則判斷為陽性，否則為陰性；當(dāng)ct值≥37或無擴增曲線，結(jié)果為陰性。

17、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

18、本發(fā)明提供了一種凍干型黃顙魚杯狀病毒的熒光定量pcr技術(shù)檢測試劑盒，所述試劑盒中的pcr?mix為可凍干試劑，各組分與凍干保護劑相互配合，在具有高靈敏度、高特異性的同時，還能保證常溫下的穩(wěn)定，無需復(fù)雜的冷鏈物流，降低了運輸和儲存的成本與復(fù)雜性。其次，使用時只需加入適當(dāng)?shù)娜軇┘纯裳杆倩謴?fù)活性，簡化了實驗步驟。此外，凍干技術(shù)允許將多種不相容的試劑共同凍干，減少了交叉污染的風(fēng)險，解決了現(xiàn)有黃顙魚杯狀病毒檢測試劑保存穩(wěn)定差、對溫度敏感、實驗操作復(fù)雜，從而檢測結(jié)果不穩(wěn)定的問題。

19、本發(fā)明還提供了使用該試劑盒檢測黃顙魚杯狀病毒的方法，并優(yōu)化了pcr擴增條件，可以快速準(zhǔn)確檢測黃顙魚杯狀病毒，操作簡單，易于在偏遠地區(qū)等資源有限的環(huán)境中使用，而且減少了操作過程中可能出現(xiàn)的人為錯誤，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時在緊急情況下，也有利于快速開展大規(guī)模的病毒篩查以及實現(xiàn)對黃顙魚杯狀病毒實時監(jiān)測，有利于魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，也為黃顙魚杯狀病毒檢測技術(shù)提供了新思路。

技術(shù)特征：

1.一種凍干型黃顙魚杯狀病毒的熒光定量pcr技術(shù)檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括pcr?mix，陽性對照、陰性對照、復(fù)溶劑；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干型黃顙魚杯狀病毒的熒光定量pcr技術(shù)檢測試劑盒，其特征在于，所述pcr?mix還包括1u~10u?rnase抑制劑、體積比為1%~50%的甘油、10mm~200mm鉀離子、0.01~1mm?edta、20mm~80m且ph為7.5~8.9的tris-hcl、10mm~50mm含u的dntp、100mm~4m?kcl、1mm~50mm?mgcl2、體積比為0.01~0.3%的tween-20、體積比為0.01~0.1%的四氫噻吩1-氧化物、10mm~5m四甲基氯化銨、10mm~100mm甜菜堿、體積比為0.01~0.1%的dmso、體積比為0.01~0.3%的triton?x-100。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干型黃顙魚杯狀病毒的熒光定量pcr技術(shù)檢測試劑盒，其特征在于，所述pcr?mix還包括0.5~2u熱啟動taq酶、0.5~5u反轉(zhuǎn)錄酶、0.1u~10u?udg酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干型黃顙魚杯狀病毒的熒光定量pcr技術(shù)檢測試劑盒，其特征在于，所述pcr?mix還包括體積比為30.3%的凍干保護劑。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的凍干型黃顙魚杯狀病毒的熒光定量pcr技術(shù)檢測試劑盒，其特征在于，所述凍干保護劑包括海藻糖1~15%、蔗糖1~15%、甘露醇1~15%、聚乙二醇0.01~0.5%、2%~10%卵磷脂和2%~10%環(huán)糊精。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干型黃顙魚杯狀病毒的熒光定量pcr技術(shù)檢測試劑盒，其特征在于，所述復(fù)溶劑為nuclease-free?water。

7.一種非診斷目的檢測黃顙魚杯狀病毒的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1~6任一項所述的凍干型黃顙魚杯狀病毒的熒光定量pcr技術(shù)檢測試劑盒。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr擴增反應(yīng)條件為：50℃?1min；95℃2min；95℃?10s，59℃?30s，40個循環(huán)。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述結(jié)果判定為：當(dāng)ct值＜35，則結(jié)果為陽性；當(dāng)35≤ct＜37擴增曲線呈s型，可疑樣本需復(fù)檢；復(fù)檢結(jié)果一致則判斷為陽性，否則為陰性；當(dāng)ct值≥37或無擴增曲線，結(jié)果為陰性。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種凍干型黃顙魚杯狀病毒的熒光定量PCR技術(shù)檢測試劑盒，屬于生物診斷技術(shù)領(lǐng)域。所述試劑盒包括序列如SEQ?ID?NO.1所示的上游引物、如SEQ?ID?NO.2所示的下游引物和如SEQ?ID?NO.3所示的Taqman熒光探針；所述試劑盒還包括特定配比的海藻糖、蔗糖、甘露醇、聚乙二醇、卵磷脂和環(huán)糊精組成的凍干保護劑，將凍干保護劑加入到PCR?mix中后進行凍干，凍干后的產(chǎn)品有利于室溫保存和運輸。本發(fā)明還提供了使用該試劑盒檢測黃顙魚杯狀病毒的方法，并優(yōu)化了PCR擴增條件，不僅能快速檢測黃顙魚杯狀病毒，還具有高靈敏性、高特異性以及良好的檢測穩(wěn)定性等特點，有利于魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

技術(shù)研發(fā)人員：馬鈴鈴,譚杰峰,凌嘉慧,付英豪,徐艷瓊
受保護的技術(shù)使用者：廣州奕昕生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10