本發(fā)明涉及基因工程，具體為黃花蒿u6啟動子及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、crispr/cas9系統(tǒng)是一種高效的基因組編輯工具，在編輯對象的基因組特定位點實現(xiàn)堿基的敲除、替換和插入等功能。sgrna的轉(zhuǎn)錄在雙子葉植物中常由u6啟動子驅(qū)動，u6啟動子具有明確的轉(zhuǎn)錄起始位點g，能精準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄sgrna，減少脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生。然而，u6啟動子通常具有種屬特異性，使用轉(zhuǎn)化物種本身或親緣關(guān)系較近物種的u6啟動子能夠取得更高的啟動效率。

2、黃花蒿為菊科一年生草本，具有清熱解暑、除蒸、截瘧等功效，其主要的活性成分為青蒿素及其衍生物，是治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾最有效的藥物，因而市場需求量逐年增加。而目前關(guān)于黃花蒿的u6啟動子相關(guān)研究尚未見報道，嚴(yán)重制約了黃花蒿高效基因編輯技術(shù)的發(fā)展。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、(一)解決的技術(shù)問題

2、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了黃花蒿u6啟動子及應(yīng)用，解決了上述背景技術(shù)所提出的問題。

3、(二)技術(shù)方案

4、為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：黃花蒿u6啟動子，包括以下序列中的任一序列：

5、(1)aau6-3啟動子序列，其核苷酸序列為：上游引物：5’-cccaaatacagaaagaaatgc-3’，下游引物：5’-gggccatgctaatcttctc-3’；

6、(2)aau6-1啟動子序列，其核苷酸序列為：上游引物：5’-tgcacaaggatttcatcttaa-3’，下游引物：5’-gggccatgctaatcttctc-3’；

7、(3)aau6-5啟動子序列，其核苷酸序列為：上游引物：5’-cggtattcagattagttcgc-3’，下游引物：5’-gggccatgctaatcttctc-3’；

8、所述黃花蒿u6啟動子驅(qū)動向?qū)na(sgrna)的高效表達(dá)。

9、優(yōu)選的，所述黃花蒿u6啟動子與cri?spr/cas9基因編輯系統(tǒng)結(jié)合使用。

10、優(yōu)選的，所述黃花蒿u6啟動子與黃花蒿的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)合使用。

11、一種包含上述黃花蒿u6啟動子的表達(dá)載體，用于在黃花蒿中表達(dá)sgrna。

12、一種用于篩選和鑒定黃花蒿u6啟動子的方法，包括以下步驟：

13、步驟一：從黃花蒿基因組中篩選克隆出同源性較高的u6啟動子；

14、步驟二：構(gòu)建包含所述u6啟動子序列的融合表達(dá)載體；

15、步驟三：將所述融合表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)化到本氏煙草葉片中；

16、步驟四：通過活體成像和雙熒光素酶分析實驗檢測所述u6啟動子的轉(zhuǎn)錄活性；

17、步驟五：篩選出轉(zhuǎn)錄活性顯著高于擬南芥atu6-26的黃花蒿內(nèi)源u6啟動子。

18、優(yōu)選的，還包括通過啟動子截斷和黃花蒿的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)一步驗證已獲得黃花蒿內(nèi)源aau6啟動子的活性和基因編輯效率。

19、黃花蒿u6啟動子或表達(dá)載體在藥用植物黃花蒿基因編輯中的應(yīng)用。

20、黃花蒿u6啟動子或表達(dá)載體在藥用植物黃花蒿品種改良中的應(yīng)用。

21、黃花蒿u6啟動子或表達(dá)載體在藥用植物黃花蒿中表達(dá)sgrna的應(yīng)用。

22、(三)有益效果

23、本發(fā)明提供了黃花蒿u6啟動子及應(yīng)用。具備以下有益效果：

24、1、本發(fā)明提供了具有高轉(zhuǎn)錄活性的黃花蒿u6啟動子，能夠有效提高sgrna的表達(dá)水平，從而提高基因編輯效率。

25、2、通過使用本發(fā)明的黃花蒿u6啟動子，可以實現(xiàn)對黃花蒿及其他植物的高效基因編輯，為植物品種改良提供新的技術(shù)手段。

26、3、本發(fā)明的黃花蒿u6啟動子具有種屬特異性，能夠減少非特異性編輯，提高基因編輯的準(zhǔn)確性。

27、綜上所述，本發(fā)明為黃花蒿及其他植物的基因編輯提供了新的工具，具有重要的應(yīng)用價值和廣闊的市場前景。

技術(shù)特征：

1.黃花蒿u6啟動子，其特征在于：包括以下序列中的任一序列：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃花蒿u6啟動子，其特征在于：所述黃花蒿u6啟動子與crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)結(jié)合使用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的黃花蒿u6啟動子，其特征在于：所述黃花蒿u6啟動子與黃花蒿的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)合使用。

4.一種包含權(quán)利要求1所述的黃花蒿u6啟動子的表達(dá)載體，其特征在于：用于在黃花蒿中表達(dá)sgrna。

5.一種用于篩選和鑒定黃花蒿u6啟動子的方法，其特征在于：包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于篩選和鑒定黃花蒿u6啟動子的方法，其特征在于：還包括通過啟動子截斷和黃花蒿的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)一步驗證已獲得黃花蒿內(nèi)源aau6啟動子的活性和基因編輯效率。

7.黃花蒿u6啟動子或表達(dá)載體在藥用植物黃花蒿基因編輯中的應(yīng)用。

8.黃花蒿u6啟動子或表達(dá)載體在藥用植物黃花蒿品種改良中的應(yīng)用。

9.黃花蒿u6啟動子或表達(dá)載體在藥用植物黃花蒿中表達(dá)sgrna的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供黃花蒿U6啟動子及應(yīng)用，涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從黃花蒿基因組中篩選并克隆了8個內(nèi)源U6啟動子，序列對比分析發(fā)現(xiàn)這8個啟動子均含有保守的、影響其轉(zhuǎn)錄活性的兩個順式作用元件USE和TATA?box。實驗構(gòu)建黃花蒿U6啟動子驅(qū)動螢火蟲熒光素酶基因(LUC)表達(dá)的融合表達(dá)載體，瞬時轉(zhuǎn)化本氏煙草葉片，通過活體成像和雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測比較各個啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果表明，AaU6?3、AaU6?1、AaU6?5啟動子的轉(zhuǎn)錄活性均顯著高于擬南芥AtU6?26，其中AaU6?3活性最高。綜上，本研究篩選鑒定了3個具有較高轉(zhuǎn)錄活性的黃花蒿內(nèi)源U6啟動子，為黃花蒿基因編輯提供高效的啟動子元件，對黃花蒿的分子育種和青蒿素的高效原料生產(chǎn)具有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：師玉華,蒲雨婷,向麗,王夢月,鄔蘭,尹青崗,高冉冉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10