本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種用于快速檢測多粘菌素b發(fā)酵液的方法。

背景技術(shù)：

1、自然界中的微生物不具備“高產(chǎn)、穩(wěn)定、生存能力強(qiáng)、易繁殖”的特性。而對于發(fā)酵產(chǎn)品來說，菌種是決定發(fā)酵企業(yè)產(chǎn)品價(jià)值的關(guān)鍵，企業(yè)必須具備良好的菌種資源庫，才能有通過改進(jìn)發(fā)酵工藝和設(shè)備以提高產(chǎn)品價(jià)值的希望。

2、對于菌種選育來說，不僅需要對菌種進(jìn)行誘變和特定的基因改造，篩選技術(shù)同樣重要，而目前關(guān)于多粘類芽孢桿菌高產(chǎn)菌種的獲得方法的相關(guān)研究比較少。同時(shí)，大部分篩選依然采用傳統(tǒng)搖瓶篩選方法，包括培養(yǎng)皿的單菌落分離培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵以及依賴于高效液相色譜儀的發(fā)酵液含量檢測。其存在篩選量小，效率低，設(shè)備占有率大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力的問題，并且液相檢測成本較高，時(shí)間較長，檢測樣品數(shù)量少。因此，研究一種快速高效、準(zhǔn)確的快速檢測多粘菌素b發(fā)酵液的方法具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)的局限，本發(fā)明提供了一種用于快速檢測多粘菌素b發(fā)酵液的方法。目的在于提高多粘菌素b發(fā)酵液的檢測效率。

2、為解決上述問題，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種多粘類芽孢桿菌的孔板培養(yǎng)條件：使用48孔板替代搖瓶，單孔培養(yǎng)基裝量由搖瓶單瓶50ml裝量降低為1-1.2ml。使用無菌牙簽輕輕挑取一半成熟單菌落至48孔板，在32℃，180rpm條件下振蕩培養(yǎng)56h。

4、本發(fā)明提供了一種用于快速檢測多粘菌素b發(fā)酵液的方法，包括以下步驟：

5、(1)稱取多粘菌素b標(biāo)準(zhǔn)品，使用超純水溶解配置成濃度為1000u/ml的抗生素原液，然后再使用超純水將配置成的多粘菌素b抗生素原液分別稀釋至濃度為0、60、70、80、90、100、110、120u/ml的溶液。

6、(2)取大腸桿菌凍存管加入lb培養(yǎng)基，調(diào)整菌液吸光值為a600nm＝0.200-0.300。將已經(jīng)混勻的指示菌大腸桿菌菌液，按照270μl/孔的裝量分裝到兩個(gè)96孔板中，分別用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和發(fā)酵液檢測。

7、(3)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。取一個(gè)加入大腸桿菌菌液的孔板，分別加入30μl不同濃度無菌標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合均勻，設(shè)孔板一列8孔為平行。同時(shí)，空白對照采用空白lb培養(yǎng)基，陽性對照選取不加抗生素的菌懸液，加入無菌超純水30μl補(bǔ)齊體積。于32℃靜置培養(yǎng)4h后，使用酶標(biāo)儀于a600nm波長下進(jìn)行吸光度的測定，檢測各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光值。以吸光值為橫坐標(biāo)x，以溶液濃度為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，添加x、y的線性關(guān)系，使得相關(guān)系數(shù)r2≥0.99即可使用。

8、(4)發(fā)酵液檢測。吸取離心后的孔板發(fā)酵液上清液，加入無菌超純水稀釋100倍，依次吸取30μl稀釋液加入另一個(gè)加入大腸桿菌菌液的孔板中，混合均勻后，于32℃靜置培養(yǎng)4h后，使用酶標(biāo)儀于a600nm波長下進(jìn)行吸光度的測定。

9、(5)生物活性數(shù)據(jù)計(jì)算。將檢測得到的發(fā)酵液吸光值數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算得到的溶液濃度乘以稀釋倍數(shù)等于發(fā)酵液生物活性數(shù)據(jù)，選擇生物活性高的菌株進(jìn)行保存。

10、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有以下優(yōu)勢：

11、1.本發(fā)明采用菌株初篩發(fā)酵培養(yǎng)使用48孔孔板，擴(kuò)大菌株篩選通量，減少培養(yǎng)基用量，單人單次實(shí)驗(yàn)篩選通量達(dá)288個(gè)單菌落。有效解決了工作強(qiáng)度大、挑取樣品數(shù)量少、篩選可能性低、設(shè)備占有率高、液相檢測樣品量少、耗時(shí)長的問題，提高了檢測效率。

12、2.本發(fā)明利用生物比濁法，根據(jù)菌株發(fā)酵液對大腸桿菌的抑制程度，可高效快速通過檢測板混濁度判定篩選菌株的產(chǎn)目的產(chǎn)物的能力，增加了篩選到優(yōu)良菌株的可能性。

13、3.本發(fā)明篩選工藝操作簡單，準(zhǔn)確快速，為其他菌株篩選提供了參考。

技術(shù)特征：

1.一種用于快速檢測多粘菌素b發(fā)酵液的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于快速檢測多粘菌素b發(fā)酵液的方法，其特征在于：所述步驟(2)中單孔培養(yǎng)基裝量為1-1.2ml，使用無菌牙簽挑取一半成熟單菌落至48孔板，在32℃，180rpm條件下振蕩培養(yǎng)56h。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于快速檢測多粘菌素b發(fā)酵液的方法，其特征在于，所述步驟(2)中生物比濁法是以大腸桿菌為指示菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于快速檢測多粘菌素b發(fā)酵液的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的快速檢測由以下步驟組成：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種用于快速檢測多粘菌素B發(fā)酵液的方法，屬于微生物領(lǐng)域，包括以下步驟：取多粘類芽孢桿菌，分別經(jīng)活化、平板單菌落分離、48孔板培養(yǎng)、96孔板生物比濁法檢測發(fā)酵液。本發(fā)明的方法使用48孔板替代搖瓶對平板分離得到的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)使用生物比濁法替代液相檢測，降低人力、物力資源的消耗，提高了單次篩選樣品量，提高了篩選、檢測效率。

技術(shù)研發(fā)人員：杜倩倩,韓冰,李猛,王成
受保護(hù)的技術(shù)使用者：河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10