本發(fā)明屬于微生物的，具體涉及短雙歧桿菌bx-18菌在調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)，緩解炎癥性腸病癥狀中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、炎癥性腸病(?inflammatory?bowel?disease，ibd)?包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative?colitis，uc)?和克羅恩病(?crohn’s?disease，cd)。目前炎癥性腸病還沒有確定的病因，主流觀點(diǎn)認(rèn)為其與微生物群紊亂，腸道免疫功能失調(diào)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)?炎癥性腸病的時(shí)空和地理分布似乎都與社會(huì)的工業(yè)化和城市化平行。

2、腸道菌群失調(diào)指宿主和腸道菌群間平衡喪失導(dǎo)致其組成和功能發(fā)生變化，是炎癥性腸病發(fā)病機(jī)理的潛在相關(guān)機(jī)制及主要特征，其特點(diǎn)為:?共生缺失，微生物群落改變，細(xì)菌多樣性減少。如不加以控制，炎癥可能會(huì)向癌癥方向發(fā)展。已有研究結(jié)果顯示，與正常人相比炎癥性腸病患者腸道中厚壁菌及擬桿菌豐度顯著下降；而變形桿菌，真菌等致病菌豐度明顯增加。目前調(diào)節(jié)腸道菌群的方式主要包括抗生素藥物，糞菌移植和益生菌制劑三種方法，但由于抗生素存在無差別滅殺腸道微生物且易誘導(dǎo)耐藥性，而糞菌移植存在供體難覓，質(zhì)量參差以及技術(shù)難度較大等問題，益生菌似乎成為了未來治療或緩解炎癥性腸病的“最優(yōu)解”。益生菌是通過定殖在人體內(nèi)，改變宿主某一部位菌群組成的一類對(duì)宿主有益的活性微生物。其種類繁多，較常見的如雙歧桿菌、乳桿菌等。益生菌改善炎癥性腸病癥狀的作用機(jī)制主要包括：改善腸道菌群失調(diào)，拮抗腸道致病菌，加強(qiáng)腸黏膜屏障，改善腸道過度免疫應(yīng)答狀態(tài)，產(chǎn)生有益代謝物質(zhì)的保護(hù)作用，減少中性粒細(xì)胞浸潤有效緩解結(jié)腸炎癥。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本申請(qǐng)的目的之一在于提供一株具有調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)，緩解炎癥性腸病癥狀的短雙歧桿菌及其應(yīng)用。該菌株于2018年分離自湖北省恩施市健康百歲老人腸道，具有較好的胃腸道消化液耐受能力。

2、本申請(qǐng)的目的之二在于提供的短雙歧桿菌bx-18在改善和緩解炎癥性腸病癥狀上的應(yīng)用；

3、進(jìn)一步的，所述短雙歧桿菌bx-18在制備食品、保健品或藥品中的應(yīng)用。

4、本申請(qǐng)的第一方面，提供一株短雙歧桿菌（bifidobacterium?breve）菌株，命名為：bx-18，所述短雙歧桿菌bx-18保藏于中國微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)：cgmccno.?28446。

5、本發(fā)明所述菌株采樣于健康百歲老人糞便中，將糞便樣品震蕩混勻，取1ml于含有0.05%?l-半胱氨酸鹽的mrs固體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48小時(shí)后，接種環(huán)挑取單菌落劃線于含有0.05%?l-半胱氨酸鹽的mrs固體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48h后，挑取白色菌落反復(fù)接種篩選，直至得到均一的單個(gè)菌落，命名為bx-18。

6、短雙歧桿菌經(jīng)革蘭氏染色為陽性，顯微鏡下呈短桿狀，電鏡下呈彎曲、短桿狀；在含有0.05%?l-半胱氨酸鹽的mrs液體培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長，久置菌體呈白色沉淀。所述短雙歧桿菌bx-18，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心。，保藏號(hào)為cgmcc?no.28446；分類名稱為短雙歧桿菌（ bifidobacterium?breve）。

7、本申請(qǐng)所述的短雙歧桿菌bx-18，具有如下生物學(xué)特性：革蘭氏陽性菌，無鞭毛、不運(yùn)動(dòng)，不形成芽孢，專性厭氧；多形態(tài)桿菌，其菌落光滑且邊緣完整，呈乳白色，閃光并有柔軟質(zhì)地。

8、本發(fā)明提供一種上述雙歧桿菌的篩選，其特征在于包括以下步驟：

9、(1)乳酸菌篩選

10、收集糞便樣品振蕩混勻后，取糞便樣品1ml，將其涂布到含有0.05%?l-半胱氨酸鹽的mrs固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)一段時(shí)間后，挑取單菌落進(jìn)一步使用含有0.05%?l-半胱氨酸鹽的mrs固體培養(yǎng)基進(jìn)行劃線分離純化，純化后再依次進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢實(shí)驗(yàn)，符合雙歧桿菌鑒定條件的菌株，用甘油保藏儲(chǔ)存在-80℃的環(huán)境下備用；

11、(2)菌種鑒定

12、采用細(xì)菌dna提取試劑盒提取分離到的菌株基因組dna，并對(duì)提取的dna進(jìn)行?16srdna序列的pcr擴(kuò)增，所得pcr產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序，測序結(jié)果進(jìn)行blast比對(duì)，從genbank中找到了相似菌株16s?rrna的基因序列，將菌株16s?rrna的基因序列進(jìn)行blast比對(duì)，最終鑒定結(jié)果確定該菌株為短雙歧桿菌。

13、所述短雙歧桿菌菌株bx-18，具有較好的耐酸耐膽鹽特性，在ph2.5的人工胃液中消化3小時(shí)存活率為65.97%，隨即在人工腸液中繼續(xù)消化8h，存活率為55.75%，能夠以活的狀態(tài)進(jìn)入人體腸道。

14、本發(fā)明還提供了上述方案所述的菌劑的制備方法，包括以下步驟：將上述方案所述的短雙歧桿菌bx-18接種于含有0.05%?l-半胱氨酸鹽的mrs培養(yǎng)基，于37℃?厭氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，得到菌劑。

15、本申請(qǐng)的第二方面提供了第一方面所述的短雙歧桿菌bx-18菌劑或者所述的制備方法制備得到的菌劑在改善炎癥性腸病癥狀中的應(yīng)用效果。

16、所述菌劑中，短雙歧桿菌的活菌數(shù)不低于1×106?cfu/ml或1×106?cfu/g。

17、可選的，所述產(chǎn)品為短雙歧桿菌乳粉或發(fā)酵劑。

18、可選的，所述產(chǎn)品為固體飲料、乳飲料或壓片糖果。

19、可選的，所述產(chǎn)品包括功能性藥品或保健品。

20、可選的，所述產(chǎn)品為使用含有所述發(fā)酵劑生產(chǎn)得到的豆制品、乳制品或果蔬制品。

21、由以上技術(shù)方案可知，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘恢暧糜诰徑庋装Y性腸病癥狀的短雙歧桿菌，所述短雙歧桿菌對(duì)胃腸消化液有良好的耐受性，能夠以活得狀態(tài)進(jìn)入腸道并定植。短雙歧桿菌bx-18通過調(diào)節(jié)體重變化率，腸道菌群組成及多樣性等途徑緩解炎癥性腸病癥狀。通過所述短雙歧桿菌在食品、益生菌固體飲料、壓片糖果、功能性藥物輔助材料等領(lǐng)域的應(yīng)用，以調(diào)節(jié)炎癥性腸病患者菌群紊亂，改善疾病癥狀進(jìn)行有效干預(yù)。

技術(shù)特征：

1.一株短雙歧桿菌bx-18，其特征在于，所述短雙歧桿菌bx-18的保藏號(hào)為cgmccno.28446，保藏地址為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的短雙歧桿菌bx-18，其特征在于，所述短雙歧桿菌菌株bx-18的16s?rrna的序列如seq?id?no.1所示。

3.含有權(quán)利要求1或2所述的短雙歧桿菌bx-18菌株的菌劑。

4.含有權(quán)利要求1或2所述的短雙歧桿菌bx-18菌株的菌劑的制備方法，其特征在于，采用培養(yǎng)基厭氧條件下培養(yǎng)。

5.含有權(quán)利要求1或2所述的短雙歧桿菌bx-18或者權(quán)利要求3所述的菌劑或者權(quán)利要求4所述的制備方法制備得到的菌劑在制備改善炎癥性腸病癥狀的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括食品、保健品、藥品。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種短雙歧桿菌BX?18菌株，其保藏號(hào)為CGMCC?NO.28446。本發(fā)明還同時(shí)公開了上述短雙歧桿菌BX?18菌株在制備提升腸道菌群穩(wěn)態(tài)，改善炎癥性腸病癥狀的食品中的應(yīng)用。本發(fā)明可作為益生菌制劑，應(yīng)用于藥物組合物、食品、保健品及食品添加劑等產(chǎn)品，用于調(diào)節(jié)腸道菌群，預(yù)防并改善炎癥性腸病等腸道疾病的發(fā)生。采用本申請(qǐng)?zhí)峁┑囊嫔苿┳鳛檎{(diào)節(jié)炎癥性腸病引發(fā)的腸道菌群紊亂的微生態(tài)制劑，具有服用簡單，無毒害作用等特點(diǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：劉文俊,何秋雯,于潔,靳昊,孫志宏
受保護(hù)的技術(shù)使用者：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17