本發(fā)明涉及干細胞培養(yǎng)技術，具體涉及一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及mmp水凝膠。

背景技術：

1、干細胞是指永久保持增生能力以及自我復制能力的細胞，它們具有分化成不同系列細胞的能力，是人體內(nèi)一種原始且未分化的細胞類型。干細胞主要分為胚胎干細胞和成體干細胞兩大類。胚胎干細胞具有分化成各種組織和各種干細胞的能力，而成體干細胞則根據(jù)來源不同，如造血干細胞、骨髓中的間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞以及肝臟干細胞等，具有不同的分化潛能。

2、間充質(zhì)干細胞是一類具有自我更新和多向分化能力的多能干細胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，包括骨髓、胎盤、臍帶、脂肪、黏膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及羊水、羊膜、臍帶血等。間充質(zhì)干細胞在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下，可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞、肝細胞、內(nèi)皮細胞等多種細胞類型。

3、間充質(zhì)干細胞能夠通過細胞間的相互作用及產(chǎn)生細胞因子，干擾樹突狀細胞功能并抑制t細胞的增殖及其免疫反應，從而發(fā)揮免疫重建的功能；且其可以從多種組織中分離得到，且易于分離、培養(yǎng)、擴增和純化，多次傳代擴增后仍具有干細胞特性。

4、在現(xiàn)有技術中，干細胞培養(yǎng)過程中需要使用大量的培養(yǎng)基、血清等生物材料，這些材料往往來源于動物，不僅資源有限，且其生產(chǎn)過程可能對環(huán)境造成污染，同時培養(yǎng)后的廢棄物處理也增加了環(huán)境負擔；

5、干細胞培養(yǎng)對環(huán)境條件的要求極為苛刻，涉及無菌操作、精確的溫度和濕度控制、以及復雜的培養(yǎng)步驟等，這些都對操作人員的技能和經(jīng)驗提出了高要求，不同種類的干細胞對培養(yǎng)條件的需求各異，進一步增加了操作的復雜性；

6、在干細胞培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)條件的不穩(wěn)定、微生物污染、化學物質(zhì)殘留等多種因素，往往導致細胞存活率低下，影響了實驗的可靠性和重復性。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及mmp水凝膠，以解決現(xiàn)有技術中的上述不足之處。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及mmp水凝膠，包括如下步驟：

3、s1、首先進行骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和初步培養(yǎng)；

4、s2、將骨髓間充質(zhì)干細胞進行凍存?zhèn)溆茫?/p>

5、s3、采用mmp水凝膠載骨髓間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)。

6、進一步地，s3所述采用mmp水凝膠載骨髓間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)包括如下步驟：

7、s31、將mmp水凝膠注入樣品瓶中，靜置后倒置以評估流動性；將mmp水凝膠添加到注射器中并用針頭注射以評估可注射性；應用流變儀在室溫下測量mmp水凝膠的粘彈性；

8、s32、將10％無菌可注射的mmp水凝膠溶液加入培養(yǎng)瓶中，在37℃條件下培養(yǎng)24小時，然后接種骨髓間充質(zhì)干細胞，將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；

9、s33、培養(yǎng)完成后在顯微鏡下觀察mmp水凝膠包裹的骨髓間充質(zhì)干細胞生長情況，待骨髓間充質(zhì)干細胞呈“羽毛狀”，融合率達80％-90％，證明骨髓間充質(zhì)干細胞在mmp水凝膠中穩(wěn)定增長。

10、進一步地，s31所述注射器規(guī)格為1ml。

11、進一步地，s31所述針頭規(guī)格為26g。

12、進一步地，s32所述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為37℃，co2含量為5％。

13、進一步地，s1所述骨髓間充質(zhì)干細胞的分離，包括如下步驟：

14、s11、脫頸處死2只sd大鼠，采用75％乙醇對處死大鼠進行全身浸泡，浸泡結(jié)束后用生理鹽水將殘留的75％乙醇沖洗干凈；

15、s12、嚴格按照無菌操作分別將大鼠的雙側(cè)脛骨、股骨和骨髓腔充分暴露，用磷酸鹽緩沖液沖洗骨髓腔3-4次；

16、s13、將骨髓腔沖洗液收集后依次進行混勻、過濾和離心，用含有10％胎牛血清、1％青鏈霉素雙抗的l-dmem培養(yǎng)基重懸細胞，隨后接種至t25細胞培養(yǎng)皿中，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育；

17、s14、孵育2天后首次換液，之后依次間隔3天換液，待細胞生長融合達90％-100％時，用0.25％胰蛋白酶-edta消化液消化細胞，p3代細胞培養(yǎng)進行成脂、成骨誘導分化，流式細胞儀檢測細胞表面抗原cd45、cd29、cd34和cd90。

18、進一步地，s11所述sd大鼠為4周齡，體重為200-300g的sd大鼠。

19、進一步地，s2所述將骨髓間充質(zhì)干細胞進行凍存?zhèn)溆茫ㄈ缦虏襟E：

20、s21、配制冷凍保存溶液；

21、s22、選取第3代細胞，用pbs反復清洗后加入0.2％胰蛋白酶消化，收集細胞懸液后置于離心機中離心；

22、s23、棄去上清液，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞；

23、s24、在取出的細胞懸液中逐滴加入等量冷凍保存溶液，并輕柔吹打直至均勻，調(diào)整細胞濃度后裝入1ml的ep管內(nèi)，然后放入-80℃液氮中凍存待用。

24、進一步地，s21所述冷凍保存溶液的配置步驟為：在室溫下依次在離心管中加入l-dmem培養(yǎng)基、血清、二甲基亞砜和濃度為20％的凍存液。

25、進一步地，s24所述細胞濃度為1～5×106個/ml。

26、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及mmp水凝膠，通過采用可降解且生物相容性極佳的基質(zhì)材料mmp水凝膠，實現(xiàn)了對干細胞微環(huán)境的精確模擬與動態(tài)調(diào)節(jié)，從而顯著提升了細胞的存活率與增殖能力，有效延長了干細胞在體外的保留時間；且培養(yǎng)方法簡便快捷，無需復雜設備或嚴苛條件，降低了生產(chǎn)成本，提高了工藝的可重復性，綠色環(huán)保，有利于大規(guī)模生產(chǎn)與臨床應用。

技術特征：

1.一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及mmp水凝膠，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述的一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及mmp水凝膠，其特征在于，s3所述采用mmp水凝膠載骨髓間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)包括如下步驟：

3.根據(jù)權利要求2所述的一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及mmp水凝膠，其特征在于，s31所述注射器規(guī)格為1ml。

4.根據(jù)權利要求2所述的一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及mmp水凝膠，其特征在于，s31所述針頭規(guī)格為26g。

5.根據(jù)權利要求2所述的一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及mmp水凝膠，其特征在于，s32所述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為37℃，co2含量為5％。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及mmp水凝膠，其特征在于，s1所述骨髓間充質(zhì)干細胞的分離，包括如下步驟：

7.根據(jù)權利要求6所述的一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及mmp水凝膠，其特征在于，s11所述sd大鼠為4周齡，體重為200-300g的sd大鼠。

8.根據(jù)權利要求1所述的一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及mmp水凝膠，其特征在于，s2所述將骨髓間充質(zhì)干細胞進行凍存?zhèn)溆茫ㄈ缦虏襟E：

9.根據(jù)權利要求8所述的一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及mmp水凝膠，其特征在于，s21所述冷凍保存溶液的配置步驟為：在室溫下依次在離心管中加入l-dmem培養(yǎng)基、血清、二甲基亞砜和濃度為20％的凍存液。

10.根據(jù)權利要求8所述的一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及mmp水凝膠，其特征在于，s24所述細胞濃度為1～5×106個/ml。

技術總結(jié)
本發(fā)明公開了一種提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及MMP水凝膠，涉及干細胞培養(yǎng)技術領域，包括如下步驟：S1、首先進行骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和初步培養(yǎng)；S2、將骨髓間充質(zhì)干細胞進行凍存?zhèn)溆?；S3、采用MMP水凝膠載骨髓間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)；該提高干細胞增殖及存活率的培養(yǎng)方法及MMP水凝膠，通過采用可降解且生物相容性極佳的基質(zhì)材料MMP水凝膠，實現(xiàn)了對干細胞微環(huán)境的精確模擬與動態(tài)調(diào)節(jié)，從而顯著提升了細胞的存活率與增殖能力，有效延長了干細胞在體外的保留時間；且培養(yǎng)方法簡便快捷，無需復雜設備或嚴苛條件，降低了生產(chǎn)成本，提高了工藝的可重復性，綠色環(huán)保，有利于大規(guī)模生產(chǎn)與臨床應用。

技術研發(fā)人員：夏春娟,王家平,卜銳,李龍,張文卿
受保護的技術使用者：昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院（云南省泌尿?qū)？漆t(yī)院、云南省肝膽胰外科醫(yī)院）
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/11/14