本發(fā)明屬于基因工程，特別涉及一種表達(dá)唾液酸化n-糖基化重組蛋白的工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、唾液酸是存在于多種生物細(xì)胞及蛋白表面的具有功能性的單糖，在生理性ph條件下帶有負(fù)電荷，重組蛋白寡糖的末端被唾液酸修飾會(huì)延長(zhǎng)其血清半衰期和改善生物治療劑的穩(wěn)定性，末端唾液酸修飾的n-糖基化重組蛋白在治療應(yīng)用中受到廣泛關(guān)注。

2、目前大部分重組蛋白藥物在真核生物表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)，其中最常用的是利用cho細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白具有生產(chǎn)成本高、周期長(zhǎng)、生產(chǎn)過程較復(fù)雜的局限性，同時(shí)n-糖基化修飾不完全、唾液酸修飾效率低也是該系統(tǒng)存在的主要問題。為了提高唾液酸修飾n-糖基化重組蛋白均質(zhì)性，meuris和他的同事在人胚腎(hek?293)衍生細(xì)胞中開發(fā)了“糖缺失”途徑，該途徑通過縮短用于糖基化修飾的糖鏈結(jié)構(gòu)，最終生產(chǎn)末端唾液酸化三糖(neu5ac-α-2,3-gal-β-1,4-glcnac-)n-糖基化修飾的重組蛋白，其唾液酸修飾效率約為75％。雖然該策略提高了真核生物系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)唾液酸修飾n-糖基化重組蛋白的均質(zhì)性，但該系統(tǒng)用于修飾的糖鏈結(jié)構(gòu)比人體中存在的糖鏈(單根天線組成至少為7糖)長(zhǎng)度短，可能會(huì)存在空間位阻而影響其功能，同時(shí)該系統(tǒng)存在高成本、周期長(zhǎng)等缺陷致使其仍達(dá)不到產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供了一種表達(dá)唾液酸化n-糖基化重組蛋白的工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明通過大腸桿菌crispr/cas9雙質(zhì)粒系統(tǒng)peccas/pecgrna，對(duì)w3110δlacz基因組分別進(jìn)行改造，使其能夠構(gòu)建唾液酸合成途徑，進(jìn)而構(gòu)建表達(dá)唾液酸化n-糖基化重組蛋白的工程菌株。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供一種表達(dá)唾液酸化n-糖基化重組蛋白的工程菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

4、(1)通過crispr/cas9雙質(zhì)粒系統(tǒng)peccas/pecgrna，將大腸埃希菌w3110中的lacz基因敲除，敲入含有placuv5-ptac啟動(dòng)子與四糖合成途徑pglb-δweca-pglk-lsgcdef的外源靶基因，得到大腸埃希菌w3110δlacz；

5、(2)通過crispr/cas9雙質(zhì)粒系統(tǒng)peccas/pecgrna，將大腸埃希菌w3110δlacz中的reca基因敲除，敲入含有ara啟動(dòng)子及neubca基因簇的外源基因，得到大腸埃希菌wl2δreca；

6、(3)將含有編碼模式蛋白基因、唾液酸合成酶及唾液酸轉(zhuǎn)移酶的雙表達(dá)框的重組載體轉(zhuǎn)入大腸埃希菌wl2δreca中，獲得表達(dá)唾液酸化n-糖基化重組蛋白的工程菌株。

7、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(1)中所述的外源靶基因的核苷酸序列如seqid?no.3所示。

8、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(1)的具體過程為：將含有placuv5-ptac啟動(dòng)子與四糖合成途徑pglb-δweca-pglk-lsgcdef的外源靶基因與pecgrna-n20質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入含有peccas質(zhì)粒的大腸埃希菌w3110感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性單克隆，消除僅含有pecgrna-n20質(zhì)粒和peccas質(zhì)粒的重組菌，得到大腸埃希菌w3110δlacz。

9、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(1)中消除僅含有pecgrna-n20質(zhì)粒和peccas質(zhì)粒的重組菌的過程為：將陽(yáng)性單克隆依次分別接種到含有kan+鼠李糖的lb培養(yǎng)基中和含有蔗糖lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

10、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(1)中所述的n20的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

11、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(1)中所述的轉(zhuǎn)入的方式為電轉(zhuǎn)化法，電壓為1500～2000v，時(shí)間為3～10ms。

12、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(2)中所述的外源基因的核苷酸序列如seq?idno.5所示。

13、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(2)的具體過程為：將含有ara啟動(dòng)子及neubca基因簇的外源基因與pecgrna-n20質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入含有peccas質(zhì)粒的大腸埃希菌w3110δlacz感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性單克隆，消除僅含有pecgrna-n20質(zhì)粒和peccas質(zhì)粒的重組菌，得到大腸埃希菌wl2δreca。

14、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(2)中消除僅含有pecgrna-n20質(zhì)粒和peccas質(zhì)粒的重組菌的過程為：將陽(yáng)性單克隆依次分別接種到含有kan+鼠李糖的lb培養(yǎng)基中和含有蔗糖lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

15、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(2)中所述的n20的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

16、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(2)中所述的轉(zhuǎn)入的方式為電轉(zhuǎn)化法，電壓為1500～2000v，時(shí)間為3～10ms。

17、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(3)中所述的模式蛋白為fn3?3.4.4。

18、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(3)中所述的重組載體包含amp、cole1復(fù)制區(qū)、阻遏蛋白基因laci、plac-模式蛋白fn3?3.4.4-終止子表達(dá)框和p-唾液酸轉(zhuǎn)移酶plst6-終止子表達(dá)框。

19、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(3)中所述的重組載體中唾液酸轉(zhuǎn)移酶plst6基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

20、本發(fā)明另一方面提供上述的構(gòu)建方法得到的表達(dá)唾液酸化n-糖基化重組蛋白的工程菌株。

21、本發(fā)明還提供所述的表達(dá)唾液酸化n-糖基化重組蛋白的工程菌株在生產(chǎn)唾液酸化n-糖基化重組蛋白中的應(yīng)用。

22、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

23、本發(fā)明構(gòu)建的唾液酸修飾n-糖基化重組蛋白途徑是模仿人源化唾液酸末端部分(neu5ac-α-2,6-gal-β-1,4-glcnac)，通過將來自嗜血桿菌的糖基轉(zhuǎn)移酶lsgcdef、空腸彎曲桿菌的neubca酶、發(fā)光桿菌屬的α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶在大腸埃希菌體中共表達(dá)，合成了唾液酸化的五糖(neu5ac-α-2,6-gal-β-1,4-glcnac-β-1,3-gal-β-1,3-glcnac-)，并在空腸彎曲菌寡糖基轉(zhuǎn)移酶pglb的作用下轉(zhuǎn)移末端唾液酸化的聚糖，進(jìn)而連接在受體蛋白的糖基識(shí)別序列上，完成唾液酸修飾n-糖基化重組蛋白的途徑，探究唾液酸轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌菌株中合成唾液酸化n-糖蛋白的效率。

技術(shù)特征：

1.一種表達(dá)唾液酸化n-糖基化重組蛋白的工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中所述的外源靶基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)的具體過程為：將含有placuv5-ptac啟動(dòng)子與四糖合成途徑pglb-δweca-pglk-lsgcdef的外源靶基因與pecgrna-n20質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入含有peccas質(zhì)粒的大腸埃希菌w3110感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性單克隆，消除僅含有pecgrna-n20質(zhì)粒和peccas質(zhì)粒的重組菌，得到大腸埃希菌w3110δlacz。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中所述的n20的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述的轉(zhuǎn)入的方式為電轉(zhuǎn)化法，電壓為1500～2000v，時(shí)間為3～10ms。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中所述的外源基因的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)的具體過程為：將含有ara啟動(dòng)子及neubca基因簇的外源基因與pecgrna-n20質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入含有peccas質(zhì)粒的大腸埃希菌w3110δlacz感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性單克隆，消除僅含有pecgrna-n20質(zhì)粒和peccas質(zhì)粒的重組菌，得到大腸埃希菌wl2δreca。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中所述的n20的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；所述的轉(zhuǎn)入的方式為電轉(zhuǎn)化法，電壓為1500～2000v，時(shí)間為3～10ms。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)中所述的模式蛋白為fn33.4.4；所述的重組載體包含amp、cole1復(fù)制區(qū)、阻遏蛋白基因laci、plac-模式蛋白fn33.4.4-終止子表達(dá)框和p-唾液酸轉(zhuǎn)移酶plst6-終止子表達(dá)框；所述的重組載體中唾液酸轉(zhuǎn)移酶plst6基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法得到的表達(dá)唾液酸化n-糖基化重組蛋白的工程菌株。

10.權(quán)利要求9所述的表達(dá)唾液酸化n-糖基化重組蛋白的工程菌株在生產(chǎn)唾液酸化n-糖基化重組蛋白中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種表達(dá)唾液酸化N?糖基化重組蛋白的工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將大腸埃希菌W3110中的lacZ基因敲除，敲入含有四糖合成途徑的外源靶基因，得到大腸埃希菌W3110ΔlacZ，然后將該大腸埃希菌中的recA基因敲除，敲入含有Ara啟動(dòng)子及neuBCA基因簇的外源基因，得到大腸埃希菌WL2ΔrecA，最后將含有編碼模式蛋白基因、唾液酸合成酶及唾液酸轉(zhuǎn)移酶重組載體轉(zhuǎn)入該大腸埃希菌中，獲得表達(dá)唾液酸化N?糖基化重組蛋白的工程菌株。本發(fā)明所構(gòu)建的大腸埃希菌可以實(shí)現(xiàn)高效唾液酸化修飾N?糖基化糖重組蛋白。

技術(shù)研發(fā)人員：丁寧,高玉亭,胡學(xué)軍,宋釔潼,蘆桐樂,吳宇航,吳瓊,張小梅,鄭洋
受保護(hù)的技術(shù)使用者：大連大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23