本發(fā)明屬于生物催化，涉及頭孢菌素c?；竿蛔凅w及及其用于一步酶法生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、頭孢類抗生素作為廣泛使用的β-內(nèi)酰胺類抗生素，約占全球市場的40％。其關(guān)鍵中間體7-氨基頭孢烷酸(7-aca)的制備，主要依賴于化學(xué)合成法和生物酶法。早期生產(chǎn)多采用化學(xué)合成法，但由于其工藝復(fù)雜、能耗高且產(chǎn)生大量污染物，逐漸被更為環(huán)保的生物酶法所取代。生物酶法分為兩步酶法和一步酶法。兩步酶法首先利用d-氨基酸氧化酶(daao)將頭孢菌素c(cpc)轉(zhuǎn)化為戊二?；?7-氨基頭孢烷酸(gl-7-aca)，隨后通過?；笇⑵滢D(zhuǎn)化為7-aca。然而，該工藝成本較高，且副產(chǎn)物過氧化氫(h2o2)對cpc有降解作用，增加了生產(chǎn)的復(fù)雜性。

2、為了簡化工藝并降低成本，開發(fā)了一步酶法，直接利用cpc?；笇pc轉(zhuǎn)化為7-aca。近年來，一些基因工程研究已嘗試提高cpc酰化酶對cpc的酶活性，通過對pseudomonassp.se83來源的cpc酰化酶進行改造，獲得了酶活性比野生型酶高出幾十倍的突變體，但此類酶仍存在較強的7-aca產(chǎn)物抑制性，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。pseudomonas?sp.gk16來源的cpc?；竿蛔凅wi215v/f228v/v240f/a306t/y323t/f347l/v552l/r553l/h623t(cn105543201b)，在水解cpc生成7-aca的活性上相較野生型酶提高了150倍，同時提高了底物特異性且降低了產(chǎn)物抑制性。此外，pseudomonas?sp.p130來源的cpc?；竿蛔凅w130-ed2：g25d/i215v/f228v/v240f/y323t/f347l/h623t(cn?109072215?b)相比野生型酶提高了54倍，并在此基礎(chǔ)上進一步開發(fā)了突變體130-v34，酶活性比130-ed2提高了2.9倍，同時改善了酶的穩(wěn)定性(cn?111172142?b)。

3、根據(jù)cn?117247925?a的描述，發(fā)明人通過對bosea?sp.ok403來源的cpc?；高M行基因工程改造，開發(fā)了一系列具有更高酶活性的突變體，顯著提升了其對頭孢菌素c鈉鹽的催化效率。然而，為了滿足工業(yè)生產(chǎn)的高標準，仍需進一步提高酶的活性。因此，本發(fā)明致力于開發(fā)一種酶活性更高的cpc?；竿蛔凅w，以在工業(yè)生產(chǎn)中展現(xiàn)更大的應(yīng)用潛力。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了提高cpc?；傅拿富钚裕景l(fā)明通過理性設(shè)計和定向進化等技術(shù)對現(xiàn)有的cpc?；高M行改造和篩選，構(gòu)建高酶活性的cpc?；竿蛔凅w。

2、通過定點突變技術(shù)繼續(xù)對cn?117247925?a中的l159s/a419v突變體(氨基酸序列如se?q?id?no：1所示)進行改造，獲得以cpc作為底物的高酶活的cpc?；竿蛔凅w。具體而言，本發(fā)明包括如下技術(shù)方案。

3、一種頭孢菌素c?；?cpc酰化酶)突變體，其在seq?id?no:1所示氨基酸序列上第g160、l161、l162、g164、w167、w171、l174、s238、d258、p259、h260、v262、t306、h307、f309、i312、l376、h415、p603、l707位進行替換突變得到的蛋白質(zhì)。

4、所述突變頭孢菌素c?；高M行的選自以上20個位點中任一位點突變?yōu)榘腚装彼峄蚣琢虬彼岬玫降牡鞍踪|(zhì)：

5、(1)g160為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

6、(2)l161為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

7、(3)l162為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

8、(4)g164為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

9、(5)w167為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

10、(6)w171為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

11、(7)l174為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

12、(8)s238為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

13、(9)d258為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

14、(10)p259為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

15、(11)h260為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

16、(12)v262為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

17、(13)t306為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

18、(14)h307為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

19、(15)f309為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

20、(16)i312為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

21、(17)l376為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

22、(18)h415為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

23、(19)p603為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

24、(20)l707為半胱氨酸、甲硫氨酸所取代；

25、在一種實施方式中，上述改變是指第171位w替換為m(即w171m)、第174位l替換為m(即l174m)、第312位i替換為c(即i312c)、第707位l替換為c(即l707c)。

26、本發(fā)明的第二個方面在于提供編碼上述cpc?；竿蛔凅w的基因。

27、本發(fā)明的第三個方面在于提供包含上述基因的質(zhì)粒。該質(zhì)粒是pet系列載體，比如載體是pet-28a，但并不受限于此。

28、本發(fā)明的第四個方面在于提供表達上述編碼基因的微生物，其轉(zhuǎn)化了上述編碼基因或質(zhì)粒。

29、優(yōu)選地，上述微生物選自枯草芽孢桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母、大腸桿菌、頂頭孢霉、產(chǎn)黃青霉，優(yōu)選大腸桿菌、頂頭孢霉，更優(yōu)選大腸桿菌bl21(de3)。

30、本發(fā)明的第五個方面在于提供上述cpc?；竿蛔凅w或微生物在制備7-aca中的用途。

31、上述頭孢菌素c?；竿蛔凅w或者微生物可以用于生產(chǎn)7-aca尤其是以頭孢菌素c(即cpc)為底物原料，用上述頭孢菌素c?；竿蛔凅w或者微生物作為催化劑來催化的一步酶法生產(chǎn)7-aca的反應(yīng)。

32、生產(chǎn)7-aca可采用常規(guī)的工藝條件，比如，反應(yīng)溫度可選擇20～40℃，優(yōu)選25℃；磷酸緩沖液ph可選6.5～9.5，優(yōu)選8.0；頭孢菌素c的濃度可選擇5～80mm，優(yōu)選20mm。

33、相較于seq?id?no:1所示氨基酸序列的初始酶，本發(fā)明的cpc酰化酶突變體的酶活性明顯提高，酶活力最高提升了2.4-3倍。

技術(shù)特征：

1.一種頭孢菌素c?；竿蛔凅w，其特征在于：其在seq?id?no：1所示氨基酸序列中的g160、l161、l162、g164、w167、w171、l174、s238、d258、p259、h260、v262、t306、h307、f309、i312、l376、h415、p603、l707中的一個或多個位點存在替換突變。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述頭孢菌素c酰化酶突變體，其特征在于：所述替換突變是用半胱氨酸或甲硫氨酸進行替換；其是如下任意之一的替換突變：

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項所述的頭孢菌素c?；竿蛔凅w的編碼基因。

4.含有如權(quán)利要求3所述的編碼基因的重組載體。

5.含有如權(quán)利要求3所述的編碼基因或如權(quán)利要求4所述重組載體的重組菌株。

6.如權(quán)利要求5所述的重組菌株，其特征在于，其出發(fā)菌是枯草芽孢桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母、大腸桿菌、頂頭孢霉、產(chǎn)黃青霉，優(yōu)選大腸桿菌、頂頭孢霉，更優(yōu)選為其為e.colibl21(de3)。

7.如權(quán)利要求1或2所述的頭孢菌素c?；竿蛔凅w、權(quán)利要求3所述的編碼基因、權(quán)利要求4所述的重組載體，或權(quán)利要求5或6所述的重組菌株在制備7-氨基頭孢烷酸中的應(yīng)用。

8.一種制備7-氨基頭孢烷酸的方法，其特征在于，以頭孢菌素c為底物、用如權(quán)利要求1或2任一項所述的頭孢菌素c?；竿蛔凅w或如權(quán)利要求5或6所述的重組菌株催化生成7-氨基頭孢烷酸。

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，用權(quán)利要求1或2所述頭孢菌素c?；竿蛔凅w的純酶或全細胞的形式催化制備7-aca。

10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：頭孢菌素c突變體的濃度可選擇5~80?mm，優(yōu)選20mm；磷酸緩沖液ph可選6.5~9.5，優(yōu)選8.0；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明通過點突變方法對頭孢菌素C?；高M行改造，獲得針對CPC鈉鹽活性較高的突變體，其是在SEQ?ID?NO：1所示氨基酸序列中的G160、L161、L162、G164、W167、W171、L174、S238、D258、P259、H260、V262、T306、H307、F309、I312、L376、H415、P603、L707中的一個或多個位點存在替換突變得到。本發(fā)明的頭孢菌素C?；竿蛔凅w在一步酶法生產(chǎn)7?氨基頭孢烷酸中具有更高的酶活力，是出發(fā)頭孢菌素C酰化酶的2.4?3倍，具有實際應(yīng)用價值。

技術(shù)研發(fā)人員：孫周通,袁波,梁爽,曲戈
受保護的技術(shù)使用者：中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19