本發(fā)明屬于重要水產(chǎn)病毒檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于rt-lamp-cas14a無(wú)pam限制的水產(chǎn)神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

0、技術(shù)背景

1、神經(jīng)壞死病毒(nnv)屬于nodaviridae科betanodavirus屬，主要存在于受感染魚類的腦細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。它是一個(gè)無(wú)包膜的十二面體，直徑約為25-34nm，含有兩條單鏈rna分子，即rna?1(3.1kb)和rna2(1.4kb)。nnv可感染40多種魚類，包括鱸形目、褶形目和鱈形目等。nnv對(duì)感染魚類的致死率極高，主要表現(xiàn)為厭食、活力下降、常側(cè)臥在水下不游動(dòng)、下頜和尾鰭紅腫潰爛，發(fā)病后魚口大張。目前，nnv的防御和控制方法主要有兩種：1)通過(guò)物理或化學(xué)方法進(jìn)行消毒和滅活；2)使用疫苗(如滅活疫苗、蛋白疫苗和dna疫苗)進(jìn)行預(yù)防和控制。遺憾的是，目前還沒有有效的魚類nnv治療方法。因此，必須開發(fā)一種敏感而特異的診斷方法，以便及時(shí)有效地控制nnv的傳播。

2、目前已報(bào)道的nnv檢測(cè)方法多種多樣，包括傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)和電子顯微鏡、基于抗體的熒光免疫技術(shù)以及基于核酸的聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、定量聚合酶鏈反應(yīng)(qpcr)。然而，這些方法也存在一個(gè)或多個(gè)顯著缺陷，如耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、依賴專業(yè)技術(shù)人員和靈敏度低?；赾rispr-cas(簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列及相關(guān)蛋白)的診斷系統(tǒng)為病原體檢測(cè)提供了一個(gè)新生平臺(tái)。crispr-cas系統(tǒng)由cas內(nèi)切酶和單鏈向?qū)na(sgrna)組成。cas內(nèi)切酶在sgrna的引導(dǎo)下識(shí)別目標(biāo)，并激活其反式裂解能力，非特異性地裂解單鏈dna(ssdna)[25-27]。核酸預(yù)擴(kuò)增與crispr-cas系統(tǒng)相結(jié)合，可顯著提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。cas14a對(duì)ssdna的結(jié)合和裂解(順式或反式裂解)以及對(duì)pam依賴性(tttg/a)雙鏈dna(dsdna)的順式裂解活性均依賴于原位相鄰基序(pam)，然而，許多病毒如神經(jīng)壞死病毒的相關(guān)序列則不含pam序列，則限制了相關(guān)病毒的檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明利用rt-lamp與cas14a結(jié)合開發(fā)出一種高靈敏高特異性的病毒檢測(cè)技術(shù)，突破了無(wú)pam位點(diǎn)病毒的檢測(cè)方法限制，可有效切斷病毒傳播，減少經(jīng)濟(jì)損失，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2、針對(duì)上述問題，本發(fā)明目的在于提供一種基于rt-lamp-cas14a無(wú)pam限制的水產(chǎn)神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)方法。該方法通過(guò)在rt-lamp引物組中添加pam序列，通過(guò)60℃恒溫?cái)U(kuò)增，使目的片段含有pam位點(diǎn)，并與crispr-cas14a聯(lián)合開發(fā)的新型無(wú)pam依賴的神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)技術(shù)。

3、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

4、根據(jù)磁珠法操作步驟提取石斑魚神經(jīng)壞死病毒rna，得到待檢測(cè)rna。

5、設(shè)計(jì)并合成rt-lamp引物組，序列如下：

6、fip-pam：5’-gacgctgctcctttcccac-ttta-gaacagtccgaccccagt-3’

7、bip：5’-ggagtgttcgattgagcgtttgccgacacacaggagt-3’

8、f3：5’-agtcgttgccaaatggtgg-3’

9、b3：5’-gcggtagtctcttcaggtgt-3’

10、lf：5’-cagaggagcgtgcgggtg-3’

11、lb：5’-gatgtggtcaacgtgtcag-3’

12、所述rt-lamp反應(yīng)體系如下：

13、

14、所述rt-lamp擴(kuò)增條件為：60℃，45min。

15、rt-lamp擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳：取5μl產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳分析，有階梯狀條帶的判斷為陽(yáng)性，無(wú)條帶的為陰性。

16、根據(jù)t7?rna聚合酶體外轉(zhuǎn)錄試劑盒制備sgrna。

17、以rt-lamp擴(kuò)增產(chǎn)物為待檢測(cè)樣，使用crispr-cas14a反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)。

18、所述的crispr-cas14a反應(yīng)步驟為：2μm?cas14a，1μm?sgrna?and?2mm?buffer(20mm?tris-hcl,20mm?nacl,ph?9.0)，37℃孵育20分鐘，然后加入30mm?mgcl2,500mmssdna探針,5μl?rt-lamp擴(kuò)增產(chǎn)物，37℃反應(yīng)2h，并通過(guò)biotek?h1酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)(λex:492nm；λem:520nm)。

19、使用分子生物級(jí)別的無(wú)核酶水作為待測(cè)樣本空白對(duì)照。

20、使用未感染神經(jīng)壞死病毒的魚作為待測(cè)樣本陰性對(duì)照。

21、所述特異性檢測(cè)樣本為：大腸桿菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌和傷寒沙門氏菌。

22、所述靈敏度檢測(cè)方法：將108-101am神經(jīng)壞死病毒rna以10倍梯度進(jìn)行稀釋后進(jìn)行rt-lamp-cas14a檢測(cè)。

23、本發(fā)明利用一步法rt-lamp擴(kuò)增神經(jīng)壞死病毒rna，不需要先將其轉(zhuǎn)錄為cdna再進(jìn)行擴(kuò)增，大大降低了操作難度。因神經(jīng)壞死病毒其相關(guān)序列不具有pam序列，限制了構(gòu)建cas14檢測(cè)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的可能性，本發(fā)明通過(guò)對(duì)rt-lamp引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，使其突破了pam序列的限制，并充分利用了cas14a酶的特性，提高了神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)的靈敏度和特異性。

技術(shù)特征：

1.一種基于rt-lamp-cas14a無(wú)pam限制的水產(chǎn)神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)方法，其特征在于，設(shè)計(jì)的rt-lamp引物組可在等溫?cái)U(kuò)增后引入pam序列，含pam位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物可被cas14a和sgrna復(fù)合物特異性識(shí)別，并激活cas14的反式切割活性，非特性切割ssdna報(bào)告探針進(jìn)而得到可視化檢測(cè)信號(hào)。

2.權(quán)利要1所述的一種基于rt-lamp-cas14a無(wú)pam限制的水產(chǎn)神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)方法，其特征在于：包括一對(duì)內(nèi)引物fip-pam和bip，一對(duì)外引物f3和b3，一對(duì)環(huán)狀引物lf和lb，所述內(nèi)引物序列為：

3.權(quán)利要1所述的一種基于rt-lamp-cas14a無(wú)pam限制的水產(chǎn)神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)方法，其特征在于，所述sgrna序列為：gaacaguccgaccccaguac。

4.權(quán)利要1所述的一種基于rt-lamp-cas14a無(wú)pam限制的水產(chǎn)神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)方法，其特征在于，所述ssdna序列為：5’6-fam-tttttttttttt-3’bhq1。

5.權(quán)利要1所述的一種基于rt-lamp-cas14a無(wú)pam限制的水產(chǎn)神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種基于RT?LAMP?Cas14a無(wú)PAM限制的石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)方法，所述方法是一種基于一組特異性的神經(jīng)壞死病毒RNA?RT?LAMP擴(kuò)增引物，在FIP引物的3’端引入PAM序列，經(jīng)過(guò)60℃恒溫?cái)U(kuò)增后其產(chǎn)物被CRISPR?Cas14a特異性識(shí)別，隨后激活Cas14a酶并觸發(fā)其非特異性反式切割能力的一種方法。具體涉及水產(chǎn)病毒快速診斷領(lǐng)域。由于神經(jīng)壞死病毒RNA核酸序列不含Cas14a識(shí)別的PAM序列，本發(fā)明對(duì)RT?LAMP擴(kuò)增引物進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)RNA核酸一步法擴(kuò)增與CRISPR?Cas14a相結(jié)合，使其突破了Cas14a檢測(cè)技術(shù)的限制，為神經(jīng)壞死病毒提供一種高特異性、高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)。

技術(shù)研發(fā)人員：宋鳳閣,陽(yáng)秀芬,邵寶凱,魯琳,萬(wàn)逸
受保護(hù)的技術(shù)使用者：海南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10