本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)，尤其涉及一種增強(qiáng)型的cik細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在腫瘤治療的過程中，免疫細(xì)胞治療作為一種革命性的治療方法，顯著改變了癌癥的治療。它是一種專業(yè)的免疫療法，利用活的免疫細(xì)胞作為治療癌癥的生物制劑。

2、cik細(xì)胞是具有混合t細(xì)胞和nk細(xì)胞樣表型的異質(zhì)性免疫效應(yīng)細(xì)胞。在體外培養(yǎng)過程中，cik細(xì)胞可分泌各種細(xì)胞因子，激活巨噬細(xì)胞、nk細(xì)胞和cd8+t細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)間接殺傷效應(yīng)。cik細(xì)胞還誘導(dǎo)凋亡基因和抗腫瘤基因的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞毒性活性并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡?？梢?，cik細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)及腫瘤免疫治療中起著重要作用。

3、現(xiàn)有技術(shù)在制備cik細(xì)胞的過程中，由于加入試劑的不合理，培養(yǎng)得到的cik細(xì)胞的增殖效率和毒性有待提高，并存在安全隱患。

4、基于此，提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供增殖效率快、殺瘤效率強(qiáng)的增強(qiáng)型的cik細(xì)胞，尤其涉及一種增強(qiáng)型的cik細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)型cik細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：

4、(1)將單個(gè)核細(xì)胞與無血清培養(yǎng)基混合，培養(yǎng)至細(xì)胞密度為2～6×106個(gè)/ml；

5、(2)轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至cik細(xì)胞專用培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～7d后，加入紅豆杉提取物和人參皂苷，作用細(xì)胞2～3d；

6、(3)收集細(xì)胞，得到增強(qiáng)型的cik細(xì)胞；

7、步驟(2)所述cik細(xì)胞專用培養(yǎng)基為以gt-t1551細(xì)胞無血清培養(yǎng)基為基礎(chǔ)還包括如下濃度的組分：

8、抗cd3單克隆抗體160～200ng/ml、抗cd28單克隆抗體50～80ng/ml、白介素-21200～1400iu/ml、白介素-550～60iu/ml、白介素-1α50～60iu/ml、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液3～5μg/ml。

9、優(yōu)選的，所述無血清培養(yǎng)基以無血清的rpmi-1640培養(yǎng)基為基礎(chǔ)還包括如下濃度的組分：

10、γ-干擾素1500～2000iu/ml、人血清白蛋白12～16mg/ml、6～8％的自體血清、磷酸肌酸0.2～0.5mg/ml。

11、優(yōu)選的，步驟(1)所述培養(yǎng)的溫度為23～25℃。

12、優(yōu)選的，步驟(2)所述培養(yǎng)的溫度為36～38℃，培養(yǎng)時(shí)通入二氧化碳的濃度為4～6％，培養(yǎng)時(shí)的相對(duì)濕度為92～95％。

13、優(yōu)選的，步驟(2)中加入紅豆杉提取物的終濃度為0.1～0.3mg/ml；

14、加入人參皂苷的終濃度為0.2～0.4mg/ml。

15、優(yōu)選的，所述單個(gè)核細(xì)胞的制備方法為：利用血細(xì)胞分離機(jī)采集得到。

16、本發(fā)明還提供了所述的制備方法制備得到的增強(qiáng)型的cik細(xì)胞。

17、本發(fā)明還提供了所述的制備方法制備得到的增強(qiáng)型的cik細(xì)胞或者所述的增強(qiáng)型的cik細(xì)胞在制備治療腫瘤的制劑中的應(yīng)用。

18、本發(fā)明還提供了一種治療腫瘤的制劑，包括所述的制備方法制備得到的增強(qiáng)型的cik細(xì)胞或所述的增強(qiáng)型的cik細(xì)胞。

19、本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)型的cik細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明增強(qiáng)型cik細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：(1)將單個(gè)核細(xì)胞與無血清培養(yǎng)基混合，培養(yǎng)至細(xì)胞密度為2～6×106個(gè)/ml；(2)轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至cik細(xì)胞專用培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～7d后，加入紅豆杉提取物和人參皂苷，作用細(xì)胞2～3d；(3)收集細(xì)胞，得到增強(qiáng)型的cik細(xì)胞；步驟(2)所述cik細(xì)胞專用培養(yǎng)基為以gt-t1551細(xì)胞無血清培養(yǎng)基為基礎(chǔ)還包括如下濃度的組分：抗cd3單克隆抗體、抗cd28單克隆抗體、白介素-2、白介素-5、白介素-1α、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液。本發(fā)明專用培養(yǎng)基中加入抗cd3單克隆抗體和抗cd28單克隆抗體，抗cd3單克隆抗體作為第一信號(hào)決定免疫反應(yīng)的特異性，抗cd28單克隆抗體作為第二信號(hào)決定免疫反應(yīng)的量及其時(shí)空效應(yīng)，兩者共同作用刺激t細(xì)胞產(chǎn)生一系列的生理生化反應(yīng)，從而達(dá)到增強(qiáng)cik細(xì)胞的腫瘤殺傷能力。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液的加入與白介素-2、白介素-5、白介素-1α協(xié)同作用，具有增強(qiáng)中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬、殺傷活性。紅豆杉提取物為紫杉醇，紫杉醇具有抗腫瘤效果，人參皂苷也具有抗腫瘤效果，兩者協(xié)同作用作用cik細(xì)胞后，會(huì)增加該細(xì)胞的腫瘤殺傷能力。

20、利用本發(fā)明的方法制備得到的增強(qiáng)型的cik細(xì)胞，增殖速度快，對(duì)腫瘤的殺傷能力強(qiáng)。

技術(shù)特征：

1.一種增強(qiáng)型cik細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述無血清培養(yǎng)基以無血清的rpmi-1640培養(yǎng)基為基礎(chǔ)還包括如下濃度的組分：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述培養(yǎng)的溫度為23～25℃。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述培養(yǎng)的溫度為36～38℃，培養(yǎng)時(shí)通入二氧化碳的濃度為4～6％，培養(yǎng)時(shí)的相對(duì)濕度為92～95％。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中加入紅豆杉提取物的終濃度為0.1～0.3mg/ml；

6.根據(jù)權(quán)利要求1～5任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述單個(gè)核細(xì)胞的制備方法為：利用血細(xì)胞分離機(jī)采集得到。

7.權(quán)利要求1～6任意一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的增強(qiáng)型的cik細(xì)胞。

8.權(quán)利要求1～6任意一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的增強(qiáng)型的cik細(xì)胞或者權(quán)利要求7所述的增強(qiáng)型的cik細(xì)胞在制備治療腫瘤的制劑中的應(yīng)用。

9.一種治療腫瘤的制劑，其特征在于，包括權(quán)利要求1～6任意一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的增強(qiáng)型的cik細(xì)胞或者權(quán)利要求7所述的增強(qiáng)型的cik細(xì)胞。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種增強(qiáng)型的CIK細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明增強(qiáng)型CIK細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：(1)將單個(gè)核細(xì)胞與無血清培養(yǎng)基混合，培養(yǎng)至細(xì)胞密度為2～6×106個(gè)/mL；(2)轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至CIK細(xì)胞專用培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～7d后，加入紅豆杉提取物和人參皂苷，作用細(xì)胞2～3d；(3)收集細(xì)胞，得到增強(qiáng)型的CIK細(xì)胞。利用本發(fā)明的方法制備得到的增強(qiáng)型的CIK細(xì)胞，增殖速度快，對(duì)腫瘤的殺傷能力強(qiáng)，為腫瘤藥物的開發(fā)提供依據(jù)。

技術(shù)研發(fā)人員：葉茂,王卿,陳慧明,陳鳳嬌,賴文杰,劉洋,鄭榮杰
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣東壹加再生醫(yī)學(xué)研究院有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10