本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，涉及一種改善老齡卵母細(xì)胞質(zhì)量的培養(yǎng)液。

背景技術(shù)：

1、組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type?plasminogen?activator,tpa)在體內(nèi)多種器官和組織中大量表達(dá)，是纖維蛋白溶解途徑的關(guān)鍵酶，經(jīng)纖溶酶進(jìn)行蛋白水解加工，產(chǎn)生異二聚體絲氨酸蛋白酶。該蛋白酶裂解酶原以產(chǎn)生纖溶酶，纖溶酶是分解纖維蛋白凝塊所需的蛋白酶。因為這樣的特性，它是目前唯一獲美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的治療因腦動脈阻塞引起的缺血性中風(fēng)的藥物，已被臨床上廣泛使用。此外，tpa還參與其他生物過程，例如突觸可塑性、細(xì)胞遷移和組織重塑等。目前已有工作證明通過添加外源性tpa可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(參見：lee,s.h.et?al.tpa?regulates?neurite?outgrowth?byphosphorylation?of?lrp5/6in?neural?progenitor?cells.molecular?neurobiology49,199–215(2014))，最近的工作又表明，向培養(yǎng)基中添加適量tpa可改善皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的小鼠壁顆粒細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞的凋亡(參見：hua,q.et?al.role?of?tpa?incorticosterone-induced?apoptosis?of?mouse?mural?granulosa?and?oviductalepithelial?cells.cells?12,455(2023))。

2、卵母細(xì)胞質(zhì)量下降是雌性生殖衰老的一個重要特征，也是導(dǎo)致高齡女性生育力下降的主要原因之一。已有諸多文獻(xiàn)報道，在女性35歲以后，卵母細(xì)胞質(zhì)量開始急劇下降，其特征是非整倍體增加、氧化應(yīng)激增加、線粒體質(zhì)量下降、凋亡水平和脂質(zhì)過氧化水平升高等，可能導(dǎo)致女性的不孕、自然流產(chǎn)、胚胎阻滯等不良后果。目前，由于社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展等復(fù)雜因素，女性生育延遲已成為重要趨勢，因此改善老齡引起的卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，已成為維持高齡女性生育能力的重要舉措。

3、但當(dāng)前，改善老齡卵母細(xì)胞質(zhì)量的方法仍然很有限，目前市面上還沒有專門用于老齡卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)液，況且其安全性仍然沒有得到充分證明，因此這些研究沒有能得到大規(guī)模的應(yīng)用。因此，如研究一款更為安全的、老齡卵母細(xì)胞專用的培養(yǎng)液，將對有生育意愿但促排卵困難的高齡女性有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種更為安全的改善老齡卵母細(xì)胞質(zhì)量的培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液能應(yīng)用于30歲以上女性或8月齡以上雌性小鼠來源的卵母細(xì)胞，可顯著改善老齡卵母細(xì)胞的質(zhì)量。

2、本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、一種體外改善老齡卵母細(xì)胞質(zhì)量的培養(yǎng)液，含有終濃度為5-100nm的組織型纖溶酶原激活劑。

4、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的培養(yǎng)液中組織型纖溶酶原激活劑的終濃度為50nm。

5、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述組織型纖溶酶原激活劑是人或小鼠來源的有活性的組織型纖溶酶原激活劑的重組蛋白。

6、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，老齡卵母細(xì)胞來源于人或小鼠的任意一種。

7、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，老齡卵母細(xì)胞來源于30歲以上的人類女性或8月齡以上的雌性小鼠。

8、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述培養(yǎng)液以m2培養(yǎng)液、m16培養(yǎng)液、g-1tm?plus、czb培養(yǎng)液中的任意一種為基礎(chǔ)培養(yǎng)液添加組織型纖溶酶原激活劑的濃儲液所得。

9、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的組織型纖溶酶原激活劑的濃儲液是將tpa溶解于含有載體蛋白的緩沖液配制。

10、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述的組織型纖溶酶原激活劑的濃儲液的濃度為100μg/ml-500μg/ml。

11、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述載體蛋白為0.1％牛血清白蛋白、5％人血清白蛋白、10％胎牛血清或5％海藻糖，優(yōu)選0.1％牛血清白蛋白。

12、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述緩沖液為無菌水或磷酸鹽緩沖液；優(yōu)選磷酸鹽緩沖液。

13、組織型纖溶酶原激活劑在制備體外改善老齡卵母細(xì)胞質(zhì)量的試劑中的應(yīng)用。

14、有益效果：

15、本發(fā)明生物學(xué)實驗結(jié)果顯示：①經(jīng)過本培養(yǎng)液培養(yǎng)16小時后，12月齡小鼠的卵母細(xì)胞第一極體排出率顯著升高，表明本發(fā)明能夠顯著提高老齡小鼠卵母細(xì)胞的體外成熟率。②經(jīng)過本培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時后，12月齡小鼠的卵母細(xì)胞的碎裂率發(fā)生了明顯的下降，表明本發(fā)明能夠降低老齡小鼠卵母細(xì)胞的死亡率。③通過細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢查12月齡小鼠卵母細(xì)胞的凋亡水平，在共聚焦熒光顯微鏡下成像發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明能夠有效減少老齡小鼠卵母細(xì)胞的凋亡水平。④通過細(xì)胞脂質(zhì)過氧化探針檢查12月齡小鼠卵母細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化水平，在共聚焦熒光顯微鏡下成像發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明能夠有效減少老齡小鼠卵母細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化水平。⑤通過線粒體膜電位分析試劑盒檢查12月齡小鼠卵母細(xì)胞的線粒體膜電位，在共聚焦熒光顯微鏡下成像發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明能夠有效恢復(fù)老齡小鼠卵母細(xì)胞線粒體的膜電位，提高線粒體質(zhì)量。⑥通過線粒體深紅熒光探針檢查12月齡小鼠卵母細(xì)胞的線粒體細(xì)胞內(nèi)分布情況，在共聚焦熒光顯微鏡下成像發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明能夠有效恢復(fù)老齡小鼠卵母細(xì)胞線粒體的正常均勻分布。通過線粒體膜電位分析試劑盒檢查12月齡小鼠卵母細(xì)胞的線粒體膜電位，在共聚焦熒光顯微鏡下成像發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明能夠有效恢復(fù)老齡小鼠卵母細(xì)胞線粒體的膜電位，提高線粒體質(zhì)量。⑦通過活性氧熒光檢測12月齡小鼠卵母細(xì)胞的活性氧積累情況，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明能有效降低老齡小鼠卵母細(xì)胞的活性氧水平。⑧通過微管蛋白染色檢查12月齡小鼠卵母細(xì)胞的紡錘體組裝情況，在共聚焦熒光顯微鏡下成像發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明能夠有效降低老齡小鼠卵母細(xì)胞紡錘體異常發(fā)生率。

技術(shù)特征：

1.一種體外改善老齡卵母細(xì)胞質(zhì)量的培養(yǎng)液，其特征在于，含有終濃度為5-100nm的組織型纖溶酶原激活劑。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液，其特征在于：所述的培養(yǎng)液中組織型纖溶酶原激活劑的終濃度濃度為50nm。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液，其特征在于：所述組織型纖溶酶原激活劑是人或小鼠來源的有活性的組織型纖溶酶原激活劑的重組蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液，其特征在于：老齡卵母細(xì)胞來源于人或小鼠的任意一種。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)液，其特征在于：老齡卵母細(xì)胞來源于30歲以上的人類女性或8月齡以上的雌性小鼠。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液，其特征在于：所述培養(yǎng)液以m2培養(yǎng)液、m16培養(yǎng)液、g-1tm?plus、czb培養(yǎng)液中的任意一種為基礎(chǔ)培養(yǎng)液添加組織型纖溶酶原激活劑的濃儲液所得。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液，其特征在于：所述的組織型纖溶酶原激活劑的濃儲液是將tpa溶解于含有載體蛋白的緩沖液配制。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)液，其特征在于：所述載體蛋白為0.1％牛血清白蛋白、5％人血清白蛋白、10％胎牛血清或5％海藻糖，優(yōu)選0.1％牛血清白蛋白。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)液，其特征在于：所述緩沖液為無菌水或磷酸鹽緩沖液；優(yōu)選磷酸鹽緩沖液。

10.組織型纖溶酶原激活劑在制備體外改善老齡卵母細(xì)胞質(zhì)量的試劑中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種改善老齡卵母細(xì)胞質(zhì)量的培養(yǎng)液。該培養(yǎng)液是在卵母細(xì)胞體外成熟基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加5?100nM組織型纖溶酶原激活劑。由于組織型纖溶酶原激活劑在體內(nèi)各個器官組織中液大量表達(dá)，這使得該培養(yǎng)液更為安全。該培養(yǎng)液能提高高齡女性卵母細(xì)胞的質(zhì)量和輔助生殖技術(shù)的成功率，在應(yīng)對有生育意愿但促排卵困難的高齡女性的卵母細(xì)胞培養(yǎng)上有較好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：王曦,何行思,閆環(huán)宇,曾瀟,張瀚文
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10