本發(fā)明涉及一種布魯氏菌病的檢測，特別涉及一種來源于布魯氏菌bmei1871蛋白的特異性多肽，還涉及所述多肽在elisa檢測試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種人畜獸共患傳染病，廣泛分布于世界各地。檢疫布魯氏菌病最常用的方法是通過elisa方法檢測抗體，但布魯氏菌和常見的耶爾森氏菌、蒼白桿菌、根瘤菌、大腸桿菌具有很多相似的抗原，在檢測過程中常常出現(xiàn)假陽性，嚴重干擾到檢測的敏感性。為了解決這一缺陷，現(xiàn)在常用布魯氏菌脂多糖作為抗原進行包被，能獲得較好的效果。例如專利申請cn?106556701a公開了一種貴陽布魯氏菌剪輯elisa抗體檢測試劑盒，以提純的布魯氏菌脂多糖(lps)經(jīng)定量后包被96孔酶標(biāo)板，以人工免疫健康綿羊制備陽性血清，最終得到試劑盒。但布魯氏菌脂多糖或表面蛋白與某些其他屬細菌(如：蒼白桿菌、大腸桿菌和耶爾森菌)存在交叉抗原表位，降低了檢測的特異性；另一方面，要獲得脂多糖需要進行布魯氏菌的培養(yǎng)和脂多糖的提取，工序復(fù)雜且生產(chǎn)成本高，而且容易產(chǎn)生安全風(fēng)險。

2、入侵相關(guān)位點b蛋白(invasion?associated?locus?b，ialb)是與布魯氏菌同屬于根瘤菌目的巴爾通體的主要毒力因子，對巴爾通體入侵上皮細胞、真皮成纖維細胞、紅細胞和內(nèi)皮細胞具有關(guān)鍵作用。ialb多克隆抗體能抑制巴爾通體對紅細胞的入侵。ialb敲除后巴爾通體侵入細胞的能力降低約50％，互補后可恢復(fù)。

3、布魯氏菌bmei1871編碼蛋白屬于ialb家族成員，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，強毒布魯氏菌感染后的抗體譜中，bmei1871抗體水平僅次于bp26，而在a19δvirb12弱毒株中僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生很低水平的bmei1871抗體，兩者差異極顯著。

4、然而，現(xiàn)有技術(shù)中尚無基于布魯氏菌bmei1871蛋白實現(xiàn)的檢測布魯氏菌病的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有缺陷，提供一種新的特異性多肽，期望所述特異性多肽可用于檢測布魯氏菌病。

2、基于此，本發(fā)明提供一種布魯氏菌的特異性多肽，所述特異性多肽的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

3、在本發(fā)明中，所述特異性多肽來源于布魯氏菌bmei1871蛋白。

4、本發(fā)明還提供表達上述特異性多肽的重組載體或表達盒。

5、本發(fā)明還提供表達上述特異性多肽的重組細胞或重組菌。

6、本發(fā)明還驗證了所述的特異性多肽在制備預(yù)防或診斷布魯氏菌病的藥物或試劑中的應(yīng)用。

7、特別地，所述試劑是elisa檢測試劑盒或膠體金檢測試劑盒。

8、具體地，本發(fā)明提供一種用于檢測布魯氏菌病的elisa檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括預(yù)包被板、酶標(biāo)抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖液、抗體稀釋液、寫色劑和終止液，其中，所述預(yù)包被板包被所述的特異性多肽。

9、通過優(yōu)化實驗，本發(fā)明確定所述預(yù)包被板用100μl?ph9.6的終濃度為1μg·ml-1的所述的特異性多肽溶液包被，然后加入200μl含1％濃度牛血清白蛋白的pbst封閉，隨后依次分別用100倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清100μl，5000倍稀釋的標(biāo)記有辣根過氧化物酶的重組蛋白g?100μl孵育。

10、優(yōu)選地，試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清的稀釋倍數(shù)是100倍。

11、在制備預(yù)包被板時，包被時間為4℃過夜，然后用0.5％bsa封閉1小時。

12、優(yōu)選地，血清、二抗的孵育時間均為30分鐘。

13、優(yōu)選地，血清、二抗的稀釋液為0.5％bsa。

14、優(yōu)選地，每步孵育后均用300μl?tbst溶液洗滌，每步洗滌次數(shù)為5次。

15、優(yōu)選地，顯色液為100μl?tmb溶液，避光顯色15min。然后加入50μl10％硫酸溶液終止反應(yīng)。

16、優(yōu)選地，結(jié)果的判定閾值為0.3。當(dāng)od值大于等于0.3時判定為陽性，否則為陰性。

17、本發(fā)明利用布魯氏菌bmei1871蛋白的特異性多肽作為抗原，建立了一種檢測布魯氏菌抗體的elisa方法，精確性高，為布病凈化提供了有力的支撐。抗原來源方便、穩(wěn)定性高，重復(fù)性強，克服了全菌或脂多糖作為抗原的缺點。

技術(shù)特征：

1.一種布魯氏菌的特異性多肽，所述特異性多肽的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性多肽，其特征在于所述特異性多肽來源于布魯氏菌bmei1871蛋白。

3.表達權(quán)利要求1所述的特異性多肽的重組載體或表達盒。

4.表達權(quán)利要求1所述的特異性多肽的重組細胞或重組菌。

5.權(quán)利要求1所述的特異性多肽在制備預(yù)防、檢測或診斷布魯氏菌病的藥物或試劑中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述特異性多肽用于制備elisa檢測試劑盒或膠體金檢測試劑盒。

7.一種用于檢測布魯氏菌病的elisa檢測試劑盒，所述elisa檢測試劑盒包括預(yù)包被板、酶標(biāo)抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖液、抗體稀釋液、顯色劑和終止液，其特征在于所述預(yù)包被板包被權(quán)利要求1所述的特異性多肽。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于所述預(yù)包被板用100μl?ph9.6的終濃度為1μg·ml-1的權(quán)利要求1所述的特異性多肽溶液包被，然后加入200μl含1％濃度牛血清白蛋白的pbst封閉，隨后依次分別用100倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清100μl，5000倍稀釋的標(biāo)記有辣根過氧化物酶的重組蛋白g?100μl孵育。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種布魯氏菌的特異性多肽，其氨基酸序列如SEQ?IDNo.1所示，該特異性多肽來源于布魯氏菌BMEI1871蛋白。本發(fā)明還提供表達所述特異性多肽的重組載體或表達盒，以及重組細胞或重組菌。本發(fā)明驗證了所述特異性多肽在制備預(yù)防、檢測或診斷布魯氏菌病的藥物或試劑中的應(yīng)用，還提供了一種用于檢測布魯氏菌病的ELISA檢測試劑盒。本發(fā)明利用布魯氏菌BMEI1871蛋白的特異性多肽作為抗原，建立了一種檢測布魯氏菌抗體的ELISA方法，精確性高，為布病凈化提供了有力的支撐?？乖瓉碓捶奖?、穩(wěn)定性高，重復(fù)性強，克服了全菌或脂多糖作為抗原的缺點。

技術(shù)研發(fā)人員：劉寶山,王浩,張婷婷,代延倩,劉想,楊昊延,謝彬,楊國麗
受保護的技術(shù)使用者：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17