本發(fā)明涉及生物，具體涉及環(huán)黃芪醇在延緩細胞衰老及提高其傳代次數(shù)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、許多地方豬因新品種的引進、病毒感染、棲息地破壞和氣候變化等因素瀕臨滅絕。建立瀕危豬種體細胞基因庫已經(jīng)成為保存其遺傳信息的重要方式之一，以備將來的恢復(fù)或利用。原代細胞系由于缺乏端粒酶活性，在體外培養(yǎng)時僅能進行有限次數(shù)的分裂。當供體動物年齡大或培養(yǎng)過程操作不當還會導(dǎo)致早期培養(yǎng)物中的細胞過早衰老，嚴重限制了后期細胞的傳代次數(shù)與研究應(yīng)用。

2、目前可以通過多種途徑延緩細胞的衰老程度，包括基因編輯或添加端粒酶激活劑激活細胞端粒酶活性、在細胞培養(yǎng)基中添加抗氧化物質(zhì)或生長因子、抑制細胞衰老相關(guān)分泌表型或激活衰老細胞的凋亡通路等。具體的操作方法為：通過慢病毒感染人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(htert)可以獲得的永生化細胞，使細胞的分裂能力不受限制。添加senolytics類藥物例如bcl-2家族抑制劑或hsp90抑制劑在細胞培養(yǎng)基中，激活衰老細胞凋亡通路并選擇性地消除衰老細胞。在細胞培養(yǎng)基中添加生長因子和激素，如egf、fgf等，抗氧化劑如維生素c、e等，可以減少氧化應(yīng)激對細胞的損傷，延緩細胞的衰老。

3、目前在市面上存在多種類型的抗衰老藥物。其中，抗氧化劑如維生素c、維生素e抗衰效果不顯著。ampk激活劑如大黃素、二甲雙胍等；sirtuin激活劑如雷帕霉素(resveratrol)等。這些藥物可以延緩細胞的衰老速度，使細胞保持更長時間的健康狀態(tài)。但這些藥物可能存在潛在的毒副作用，其長期使用的安全性和穩(wěn)定性尚未完全確定。不同物種甚至是個體對藥物的反應(yīng)存在差異。同時，一些新型藥物可能在經(jīng)濟和可及性方面存在問題，限制了其廣泛應(yīng)用。利用基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)將外源性永生化基因?qū)爰毎麅?nèi)能夠解決細胞衰老與擴增的問題，但永生化細胞作為體細胞核移植的供體細胞時，能夠正常發(fā)育的胚胎極少，還容易出現(xiàn)染色體異常等問題。

4、環(huán)黃芪醇是一種三萜皂苷成分，最初從傳統(tǒng)草藥黃芪中提取?；谇捌谘芯?，環(huán)黃芪醇在體外和體內(nèi)都可以上調(diào)衰老細胞的端粒酶活性，促進端粒延長，延緩細胞衰老。例如，在體內(nèi)研究中，通過注射環(huán)黃芪醇恢復(fù)了雌性小鼠的短端粒，并減輕了小鼠卵巢組織中與年齡相關(guān)的功能障礙。在體外研究中，環(huán)黃芪醇主要以端粒酶依賴性方式激活端粒酶并延長端粒，降低了細胞中極短端粒的百分比。但現(xiàn)有技術(shù)中對于環(huán)黃芪醇在延緩延緩耳緣成纖維細胞衰老及傳代次數(shù)方面并無任何研究。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種環(huán)黃芪醇在延緩細胞衰老及提高其傳代次數(shù)中的應(yīng)用，本發(fā)明所采用的環(huán)黃芪醇既對細胞無潛在的毒副作用，又能夠延緩細胞衰老及傳代次數(shù)，應(yīng)用成本低和可行性高，并給出了其最佳的使用的方案。

2、本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

3、本發(fā)明提供了環(huán)黃芪醇在延緩細胞衰老及提高其傳代次數(shù)中的應(yīng)用。

4、進一步的，所述環(huán)黃芪醇通過提高細胞的相對端粒酶活性延緩細胞衰老及提高其傳代次數(shù)。

5、進一步的，所述環(huán)黃芪醇的有效劑量為25-100μm，處理時間為12-24h。

6、進一步的，p3、p6代細胞使用所述環(huán)黃芪醇的有效劑量為100μm，處理時間為24h；p6代細胞使用所述環(huán)黃芪醇的有效劑量為100μm，處理時間為12h。

7、進一步的，所述細胞為豬體細胞。

8、進一步的，所述豬體細胞為豬耳緣成纖維細胞。

9、本發(fā)明有益效果在于：

10、由于原代細胞系缺乏端粒酶活性，細胞在傳代過程易出現(xiàn)衰老，積累遺傳突變與功能障礙，嚴重限制了細胞傳代次數(shù)與后期的研究應(yīng)用，對于動物的體細胞資源保護造成巨大的困難。本發(fā)明對環(huán)黃芪醇的毒性進行了精準的檢測，針對不同代次(衰老程度)的細胞提出了不同的環(huán)黃芪醇培養(yǎng)方案，減少了藥物對細胞的毒性效應(yīng)。最終試驗結(jié)果證明，環(huán)黃芪醇能夠延緩細胞衰老。此外，環(huán)黃芪醇還可以激活成纖維細胞的端粒酶活性，延長細胞的傳代次數(shù)。本發(fā)明使用的天然的端粒酶激活劑環(huán)黃芪醇，已經(jīng)通過細胞實驗證明其在低濃度(25～100μm)、短時間(12～24h)孵育的條件下對細胞無毒副作用。最終，通過藥物毒性和抗衰試驗確定了環(huán)黃芪醇的培養(yǎng)方案為：p3、p6代細胞使用100μm環(huán)黃芪醇培養(yǎng)24h，p9代細胞使用100μm環(huán)黃芪醇培養(yǎng)12h，在該培養(yǎng)條件下能夠顯著提高細胞的相對端粒酶活性，延緩細胞的衰老水平，顯著延長細胞的傳代次數(shù)。

技術(shù)特征：

1.環(huán)黃芪醇在延緩細胞衰老及提高其傳代次數(shù)中的應(yīng)用。

2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述環(huán)黃芪醇通過提高細胞的相對端粒酶活性延緩細胞衰老及提高其傳代次數(shù)。

3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述環(huán)黃芪醇的有效劑量為25-100μm，處理時間為12-24h。

4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，p3、p6代細胞使用所述環(huán)黃芪醇的有效劑量為100μm，處理時間為24h；p6代細胞使用所述環(huán)黃芪醇的有效劑量為100μm，處理時間為12h。

5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細胞為豬體細胞。

6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述豬體細胞為豬耳緣成纖維細胞。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及環(huán)黃芪醇在延緩細胞衰老及提高其傳代次數(shù)中的應(yīng)用，所述環(huán)黃芪醇通過提高細胞的相對端粒酶活性延緩細胞衰老及提高其傳代次數(shù)。本發(fā)明使用的天然的端粒酶激活劑環(huán)黃芪醇，已經(jīng)通過細胞實驗證明其在低濃度(25μM～100μM)、短時間(12h～24h)孵育的條件下對細胞無毒副作用。最終，通過藥物毒性和抗衰試驗確定了環(huán)黃芪醇的培養(yǎng)方案為：P3、P6代細胞使用100μM環(huán)黃芪醇培養(yǎng)24h，P9代細胞使用100μM環(huán)黃芪醇培養(yǎng)12h，在該培養(yǎng)條件下能夠顯著提高細胞的相對端粒酶活性，延緩細胞的衰老水平，顯著延長細胞的傳代次數(shù)。

技術(shù)研發(fā)人員：龍熙,潘紅梅,周旗,潘雨,柴捷,陳力,張亮,吳平先,王清
受保護的技術(shù)使用者：重慶市畜牧科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10