本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)，尤其涉及一種樣本保存液及獲得大量優(yōu)質(zhì)豬耳緣成纖維細胞的方法。

背景技術(shù)：

1、豬耳緣成纖維細胞分離培養(yǎng)的意義在于建立珍貴品種豬的體細胞資源庫，實現(xiàn)遺傳材料的長久保存，并在需要時進行醫(yī)學(xué)實驗或活體復(fù)原。在進行分離培養(yǎng)時，首先需要采集豬的耳緣組織，經(jīng)過消毒清洗后，將組織置于樣本保存液中，在低溫條件下運輸回實驗室。于超凈臺內(nèi)將耳緣組織消毒清洗，分離皮膚組織并保留真皮層。將真皮層剪碎均勻鋪在細胞培養(yǎng)皿中，通過添加含有血清的培養(yǎng)基，在37℃，5％co2培養(yǎng)條件下，組織塊可以黏附在培養(yǎng)皿中并長久保持活性，新生的成纖維細胞可以從貼壁的組織塊附近游出并生長。為了保持細胞基因組的穩(wěn)定性，防止細胞老化，使用細胞冷凍保存液重懸細胞，此時細胞內(nèi)代謝活動停滯進入休眠狀態(tài)，可長期保存，并在需要時進行復(fù)蘇。因此，樣本組織的活性，分離細胞的方法，冷凍液的配比和細胞復(fù)蘇的條件均是獲得優(yōu)質(zhì)細胞的關(guān)鍵因素。

2、目前常用的豬耳緣組織樣本保存液多以生理鹽水和dpbs為主，樣本組織的活性維持時間短，通常采集后需要在短時間內(nèi)進行細胞分離培養(yǎng)。并且，已經(jīng)建立的豬耳緣成纖維細胞分離培養(yǎng)體系的細胞污染率較高，成纖維細胞的產(chǎn)量和活率均較低。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種樣本保存液及獲得大量優(yōu)質(zhì)豬耳緣成纖維細胞的方法，樣本保存液可以使組織保持較高的活性，延長保存時間達到7天以上，7天內(nèi)隨時可分離得到大量優(yōu)質(zhì)的耳緣成纖維細胞。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種樣本保存液，所述樣本保存液由10ml?dmem、500μl血清和100μl100×青霉素-鏈霉素-兩性霉素組成。

4、本發(fā)明還提供了一種利用上述樣本保存液獲得大量優(yōu)質(zhì)豬耳緣成纖維細胞的方法，包括如下步驟：

5、(1)組織采樣：選擇耳朵部位較薄且避開大血管的地方消毒，用耳號鉗在豬耳緣處取大約半個指甲蓋大小的樣本至樣本保存液中，并轉(zhuǎn)移至圈舍外；將采集的樣本上較長的毛清理干凈并消毒，消毒后用杜氏磷酸鹽溶液將酒精沖洗干凈，而后轉(zhuǎn)移至杜氏培養(yǎng)液中，得到耳組織樣本，4℃保存；

6、(2)原代細胞分離培養(yǎng)：將步驟(1)的耳組織樣本剪碎至面積小于1mm2，得到組織塊，將組織塊轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)皿中，使其均勻分布于皿底，細胞培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)，待組織塊貼壁后，正置細胞培養(yǎng)皿加入杜氏培養(yǎng)液培養(yǎng)；

7、(3)傳代培養(yǎng)：將步驟(2)原代細胞中的組織塊剔除，清洗、消化，待細胞變圓并大部分脫壁后，杜氏培養(yǎng)液終止消化，離心、重懸、接種、繼續(xù)傳代培養(yǎng)，得到豬耳緣成纖維細胞；

8、(4)冷凍：將細胞培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)液棄去，洗滌、消化，杜氏培養(yǎng)液終止消化后離心，加入冷凍液重懸豬耳緣成纖維細胞，分裝，于-80℃冰箱中冷凍，冷凍后轉(zhuǎn)入氮罐中長期儲存。

9、進一步的，步驟(2)所述原代細胞分離培養(yǎng)的溫度為37℃，倒置培養(yǎng)時間為4h～6h。

10、進一步的，步驟(3)每次進行所述傳代培養(yǎng)的條件為細胞混合度達到70％～90％，傳代時細胞傳代的比例為1:2。

11、進一步的，步驟(3)所述洗滌使用的溶液為杜氏磷酸鹽溶液，所述消化使用的酶為胰酶。

12、進一步的，步驟(4)所述洗滌使用的溶液為杜氏磷酸鹽溶液，所述消化使用的酶為胰酶。

13、進一步的，步驟(4)所述冷凍液中各成分的體積比為dmem:血清:dmso＝7:2:1。

14、本發(fā)明的有益效果：

15、(1)本發(fā)明制備了一種由10ml?dmem、500μl血清和100μl?100×青霉素-鏈霉素-兩性霉素組成的樣本保存液，樣本保存液中的血清能夠為組織提供營養(yǎng)并維持穩(wěn)定性，抗生素能夠抑制細菌和真菌的繁殖。使用該樣本保存液保存耳組織，可以使組織保持較高的活性，最長可維持組織活性7天之久，7天內(nèi)隨時可分離得到活性好，增殖速度正常的耳緣成纖維細胞。

16、(2)本發(fā)明選擇耳朵部位較薄且避開大血管的地方進行消毒采樣，隨后轉(zhuǎn)移樣本至圈舍外進行后續(xù)處理，可以有效減少真菌及細菌對樣本的污染，所用的樣本保存液中的血清能夠為組織提供營養(yǎng)并維持穩(wěn)定性，抗生素能夠抑制細菌和真菌的繁殖。在傳代培養(yǎng)時，由于成纖維細胞依賴高密度生長，本發(fā)明還調(diào)整豬耳緣成纖維細胞傳代比例為1：2，避免由于接種密度過低導(dǎo)致細胞過早老化現(xiàn)象的發(fā)生。并且，由于細胞密度過低達不到傳代要求的細胞數(shù)量，而細胞密度過高，會導(dǎo)致細胞發(fā)生接觸抑制反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡率增加，本發(fā)明還限定密度達到70％～90％再傳代培養(yǎng)。在冷凍保藏時加大冷凍液中血清的比例，更好地保存豬耳緣成纖維細胞。

技術(shù)特征：

1.一種樣本保存液，其特征在于，所述樣本保存液由10ml?dmem、500μl血清和100μl100×青霉素-鏈霉素-兩性霉素組成。

2.一種利用權(quán)利要求1所述樣本保存液獲得大量優(yōu)質(zhì)豬耳緣成纖維細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述獲得大量優(yōu)質(zhì)豬耳緣成纖維細胞的方法，其特征在于，步驟(2)所述原代細胞分離培養(yǎng)的溫度為37℃，倒置培養(yǎng)時間為4h～6h。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述獲得大量優(yōu)質(zhì)豬耳緣成纖維細胞的方法，其特征在于，步驟(3)每次進行所述傳代培養(yǎng)的條件為細胞混合度達到70％～90％，傳代時細胞傳代的比例為1:2。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述獲得大量優(yōu)質(zhì)豬耳緣成纖維細胞的方法，其特征在于，步驟(3)所述洗滌使用的溶液為杜氏磷酸鹽溶液，所述消化使用的酶為胰酶。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述獲得大量優(yōu)質(zhì)豬耳緣成纖維細胞的方法，其特征在于，步驟(4)所述洗滌使用的溶液為杜氏磷酸鹽溶液，所述消化使用的酶為胰酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述獲得大量優(yōu)質(zhì)豬耳緣成纖維細胞的方法，其特征在于，步驟(4)所述冷凍液中各成分的體積比為dmem:血清:dmso＝7:2:1。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種樣本保存液及獲得大量優(yōu)質(zhì)豬耳緣成纖維細胞的方法，屬于細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明選擇耳朵部位較薄且避開大血管的地方進行消毒采樣，隨后轉(zhuǎn)移樣本至圈舍外進行處理，可減少真菌及細菌對樣本的污染，所用的樣本保存液最長可維持組織活性7天之久，分離得到的細胞活性好，增殖速度正常。樣本保存液中的血清能夠為組織提供營養(yǎng)并維持穩(wěn)定性，抗生素能夠抑制細菌和真菌的繁殖。在傳代培養(yǎng)時，調(diào)整豬耳緣成纖維細胞傳代比例為1:2，限定密度達到70％～90％再傳代培養(yǎng)，避免由于細胞密度過低或過高導(dǎo)致細胞過早老化現(xiàn)象及細胞接觸抑制反應(yīng)的發(fā)生。在冷凍保藏時加大冷凍液中血清的比例，更好地保存豬耳緣成纖維細胞。

技術(shù)研發(fā)人員：龍熙,潘紅梅,張亮,潘雨,周旗,柴捷,陳力,張利娟,孔莎莎,張力丹,唐乙全
受保護的技術(shù)使用者：重慶市畜牧科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10