本發(fā)明涉及微生物，具體涉及一種高效農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法。

背景技術(shù)：

1、對處于快速生長階段的細菌經(jīng)過特殊處理，使其處于易于接受外源dna的狀態(tài)，該宿主細胞稱為“感受態(tài)細胞”。通過物理或化學(xué)方法，使外源dna分子進入受體細胞并產(chǎn)生新的遺傳性狀的過程稱為“轉(zhuǎn)化”。

2、農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性菌，能夠向植物細胞中轉(zhuǎn)移dna，介導(dǎo)植物的遺傳轉(zhuǎn)化過程。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化是植物轉(zhuǎn)基因過程的關(guān)鍵步驟之一。質(zhì)粒通過物理或化學(xué)方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，農(nóng)桿菌攜帶外源質(zhì)粒dna，將外源dna轉(zhuǎn)移并整合到植物細胞中，完成農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化過程。外源基因在植物中可以進行瞬時表達與穩(wěn)定遺傳表達。瞬時表達時t-dna序列不需要整合到宿主基因組中，24-48h內(nèi)即可完成蛋白高水平表達。而穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化將t-dna整合到細胞的基因組中，需要數(shù)月產(chǎn)生遺傳轉(zhuǎn)化植株，獲得新的遺傳材料。

3、感受態(tài)細胞制備的方法主要為物理法和化學(xué)法。物理法主要通過電轉(zhuǎn)法進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化且轉(zhuǎn)化效率高，然而電轉(zhuǎn)法需要昂貴的電擊設(shè)備，一般實驗室不能滿足需求?；瘜W(xué)法制備感受態(tài)細胞主要包括cacl2法、rbcl法、inoue法等，化學(xué)轉(zhuǎn)化法操作門檻低，實驗室易于制備。然而由于農(nóng)桿菌與大腸桿菌的染色體背景及細胞特性的不同，大腸桿菌感受態(tài)細胞制備的方法并不太適用于農(nóng)桿菌。目前化學(xué)法制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞主要為cacl2法，現(xiàn)有的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法轉(zhuǎn)化效率極低。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種高效農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法，用以解決上述背景技術(shù)中制備轉(zhuǎn)化效率低的問題。

2、一種高效農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法，具體的技術(shù)方案，包括：步驟1)農(nóng)桿菌的增殖培養(yǎng)；步驟2)離心集菌；步驟3)用感受態(tài)制備液重懸菌體；步驟4)保存液分裝，液氮凍存；

3、本發(fā)明為非傳統(tǒng)的使用cacl2的方法制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，替代的為使用氯化鎂與乙酰丁香酮相結(jié)合的方法，使農(nóng)桿菌細胞的通透性增加，便于質(zhì)粒dna分子轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞。

4、本發(fā)明中使用的獨特的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞保存液，其保存液中不含傳統(tǒng)的甘油、dmso等對細胞有毒性的成分，減少對感受態(tài)細胞的損傷。使用豐富的營養(yǎng)成分及離子作為保存液，一方面有助于感受態(tài)細胞抗凍性，另一方面有助于轉(zhuǎn)化后感受態(tài)細胞的恢復(fù)過程。

5、上述具體步驟如下所示：

6、1)將農(nóng)桿菌菌株在lb(利福平25mg/l)培養(yǎng)基平板上劃線，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，得到單菌落；

7、2)將步驟1)中的菌落接種至5mlyeb(利福平25mg/l)培養(yǎng)基中，28℃過夜震蕩培養(yǎng)；次日將培養(yǎng)物接種至500ml的yeb培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)至od600為0.5-0.6，冰浴30min，4000rpm、4℃離心10min，棄上清；

8、3)用20ml預(yù)冷的感受態(tài)制備液重懸菌體，4℃50-60rpm孵育10min，4000rpm、4℃離心10min，棄上清；

9、4)用20ml預(yù)冷的保存液重懸菌體，100μl/管分裝至提前預(yù)冷的ep管中，液氮速凍，-80℃冰箱保存。

10、優(yōu)選的，所述步驟1)中l(wèi)b固體培養(yǎng)基為：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，瓊脂20g，加水定容至1l。調(diào)整ph值為7.0，121℃高壓滅菌15min，倒平板。

11、優(yōu)選的，所述步驟2)中yeb液體培養(yǎng)基為：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，七水硫酸鎂0.5g，加水定容至1l，調(diào)整ph為7.0，121℃高壓滅菌15min。

12、優(yōu)選的，所述步驟3)中感受態(tài)制備液的制備方法為：氯化鎂(10-100mm，優(yōu)選為50mm)，乙酰丁香酮(50-200μm，優(yōu)選為100μm)，2-嗎啉乙磺酸(10mm)，蔗糖(1-5％，優(yōu)選為5％)，調(diào)整ph值為6.8，高溫高壓滅菌，4℃儲存。

13、優(yōu)選的，所述步驟4)中保存液的制備方法為：在900ml純凈水中依次加入胰蛋白胨20g，酵母提取物5g，氯化鈉0.5g，氯化鉀0.186g，調(diào)整ph值為6.8，高溫高壓滅菌后，加入提前滅好的1m?mgcl2和1m?mgso4各10ml，加入20ml過濾除菌的1m葡萄糖，定容至1l，4℃儲存。

14、進一步方案中，本發(fā)明所制備的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化過程通過以下步驟實現(xiàn)：

15、a)從-80℃取出感受態(tài)細胞，室溫融化后置于冰上，加入0.01-1μg質(zhì)粒dna，輕輕混勻。

16、b)冰上靜置3min，液氮速凍3min，37℃熱擊3min，繼續(xù)冰上3min。

17、c)加入700μl的lb培養(yǎng)基，28℃，200rpm震蕩培養(yǎng)1-2h。

18、d)5000rpm離心1min，棄上清，加入100μl無菌水重懸，涂布相應(yīng)的抗生素平板，28℃倒置培養(yǎng)2-3天。

19、本發(fā)明的技術(shù)效果和優(yōu)點：

20、1、提高農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率能夠減少重復(fù)轉(zhuǎn)化的次數(shù)，有助于節(jié)約科研時間，加速后續(xù)植物遺傳轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)研究進程。

21、2、與現(xiàn)有的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備技術(shù)相比，本發(fā)明制備的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞操作簡單、穩(wěn)定性好，轉(zhuǎn)化效率大大提高，可達2×104cfu/μg，具有較高的應(yīng)用價值。

技術(shù)特征：

1.一種高效農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法，其特征在于，包括：步驟1)農(nóng)桿菌的增殖培養(yǎng)；步驟2)離心集菌；步驟3)用感受態(tài)制備液重懸菌體；步驟4)保存液分裝，液氮凍存。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法，其特征在于，具體步驟如下：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法，其特征在于，所述步驟1)中l(wèi)b培養(yǎng)基為lb固體培養(yǎng)基，lb固體培養(yǎng)基包括：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，瓊脂20g，加水定容至1l；調(diào)整ph值為7.0，121℃高壓滅菌15min，倒平板。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高效農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法，其特征在于，所述步驟2)中yeb培養(yǎng)基為yeb液體培養(yǎng)基，yeb液體培養(yǎng)基包括：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，七水硫酸鎂0.5g，加水定容至1l；調(diào)整ph為7.0，121℃高壓滅菌15min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法，其特征在于，所述步驟3)中感受態(tài)制備液的制備方法為：10-100mm氯化鎂，50-200μm乙酰丁香酮，10mm?2-嗎啉乙磺酸，1-5％蔗糖，調(diào)整ph值為6.8，高溫高壓滅菌，4℃儲存。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法，其特征在于，所述步驟4)中保存液的制備方法為：在900ml純凈水中依次加入胰蛋白胨20g，酵母提取物5g，氯化鈉0.5g，氯化鉀0.186g；調(diào)整ph值為6.8，高溫高壓滅菌后，加入提前滅菌好的1m?mgcl2和1mmgso4各10ml，加入20ml過濾除菌的1m葡萄糖，定容至1l，4℃儲存。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種高效農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法，其特征在于，所述感受態(tài)制備液包括：50mm氯化鎂，100μm乙酰丁香酮，10mm2-嗎啉乙磺酸，5％蔗糖。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高效農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法，其特征在于，所述lb培養(yǎng)基、yeb培養(yǎng)基均含有25mg/l利福平。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的一種高效農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法，其特征在于，本發(fā)明所制備的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化過程通過以下步驟實現(xiàn)：

10.根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的一種高效農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法，其特征在于，本發(fā)明所制備的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率達到2×104cfu/μg。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備的方法，具體的技術(shù)方案，包括：步驟1)農(nóng)桿菌的增殖培養(yǎng)；步驟2)離心集菌；步驟3)用感受態(tài)制備液重懸菌體；步驟4)保存液分裝，液氮凍存。本發(fā)明制備的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞操作簡單、穩(wěn)定性好，轉(zhuǎn)化效率大大提高，可達2×104cfu/μg，具有較高的應(yīng)用價值。

技術(shù)研發(fā)人員：趙瑞,王奕達,李雙樂
受保護的技術(shù)使用者：北京酷來搏科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10