本發(fā)明涉及低分子透明質(zhì)酸寡糖，具體涉及一種利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法。

背景技術(shù)：

1、透明質(zhì)酸(hyaluronic?acid，ha)是一種天然的高分子酸性黏多糖，廣泛存在于動物組織細(xì)胞間質(zhì)和某些細(xì)菌的莢膜中，由n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)和d-葡萄糖醛酸(glca)二糖重復(fù)單位通過β-1,4-糖苷鍵和β-1,3-糖苷鍵構(gòu)成。透明質(zhì)酸因其良好的生物相容性和生物降解性，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如組織工程、藥物輸送、傷口愈合等。然而，透明質(zhì)酸的生物活性與其分子量的大小密切相關(guān)，分子量越小生物活性越高。

2、透明質(zhì)酸寡糖(o-ha)屬于小分子多糖,其性質(zhì)與普通ha有很大不同?,甚至具有完全相反的作用。透明質(zhì)酸寡糖(單糖殘基數(shù)量為2-40，一般為4-16)表現(xiàn)出非常強的生物活性，具有促進(jìn)創(chuàng)口愈合、促進(jìn)骨和血管生成、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性等作用，且易于滲透到真皮中。因此，透明質(zhì)酸寡糖在食品保健、化妝品及臨床醫(yī)療領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

3、由于生物酶法具有條件溫和，操作簡便，專一性強，能特異性地降解化學(xué)鍵而不對其他分子基團(tuán)產(chǎn)生影響，效率較高等優(yōu)勢，可通過控制加酶量及反應(yīng)時間得到均一的不同分子量透明質(zhì)酸，因此，生物酶法是制備低分子量透明質(zhì)酸寡糖最理想的方法。

4、現(xiàn)有技術(shù)中，透明質(zhì)酸酶主要通過微生物發(fā)酵后，經(jīng)過多步純化獲得。目前微生物來源的透明質(zhì)酸酶的表達(dá)方式主要分為兩種，一種是胞外分泌表達(dá)，如酵母、芽胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)透明質(zhì)酸酶等；一種是胞內(nèi)表達(dá)，如檸檬酸桿菌、大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)透明質(zhì)酸酶等。

5、中國專利cn117448305a公開了一種酵母發(fā)酵產(chǎn)水蛭透明質(zhì)酸酶的方法及其應(yīng)用，該發(fā)明將發(fā)酵液離心取上清，經(jīng)洗脫純化蛋白，收集洗脫峰得到粗酶液，然后經(jīng)純化后得到純酶液。該方法雖然無需進(jìn)行高壓破碎，對離心后的發(fā)酵上清液中直接純化，但是酵母發(fā)酵周期較長，需10-15天，增加了時間和人工成本。

6、中國專利cn118086255a公開了一種重組透明質(zhì)酸酶的制備方法及其應(yīng)用，該發(fā)明對發(fā)酵后的重組菌的發(fā)酵液先離心收集菌泥，菌泥重懸后進(jìn)行破碎，將破碎液離心后取上清液，經(jīng)鎳柱親和層析法進(jìn)行層析純化，收集洗脫峰，然后經(jīng)過濃縮換液，得到透明質(zhì)酸酶酶液。該方法雖然最后得到高酶活的透明質(zhì)酸酶，但是需要使用高壓均質(zhì)機進(jìn)行菌體破碎，在層析純化中還需要借助蛋白純化系統(tǒng)等高端設(shè)備，工藝繁瑣。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供了一種利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法，本發(fā)明的方法無需進(jìn)行菌體破碎，無需進(jìn)行層析純化，發(fā)酵周期短，制備工藝簡單，成本較低，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

2、為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

3、一種利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法，包括：制備全細(xì)胞催化酶液，酶解反應(yīng)，后處理；

4、所述制備全細(xì)胞催化酶液，將重組大腸桿菌菌泥按加入重懸buffer進(jìn)行菌泥重懸，得到全細(xì)胞催化酶液；

5、所述制備全細(xì)胞催化酶液中，菌泥重懸時的菌濃為1:8-12；

6、所述重組大腸桿菌菌泥為按照中國專利cn116286764b?一種透明質(zhì)酸裂解酶及其重組菌與應(yīng)用的方法得到的重組菌；

7、所述重懸buffer的成分為：25mm磷酸鹽緩沖液，500mm?nacl，ph為7.4；

8、所述酶解反應(yīng)，將純水加熱至36-38℃，加入全細(xì)胞催化酶液、透明質(zhì)酸鈉底物，在密封條件下，在36-38℃下進(jìn)行酶解反應(yīng)，得到酶解液；

9、所述酶解反應(yīng)中，所述全細(xì)胞催化酶液與純水的體積比為30-40:2000；

10、所述透明質(zhì)酸鈉底物與純水的質(zhì)量體積比為200-300g:2l；

11、所述后處理，包括：微濾，有機超濾膜分離，冷凍干燥；

12、所述微濾，對酶解液進(jìn)行微濾處理，得到微濾液；

13、所述微濾中，微濾處理時使用的微濾裝置的制備方法為：將型號為335的紙板放入布氏漏斗，然后鋪一層硅藻土；

14、所述有機超濾膜分離，使用有機超濾膜對微濾液進(jìn)行分離，待透過液的固含量在5%以上時，收集透過液；

15、所述有機超濾膜分離中，有機超濾膜的過濾精度為1wda；

16、所述有機超濾膜分離的溫度為30-35℃，壓力為0.4-0.5mpa；

17、所述冷凍干燥，對透過液進(jìn)行冷凍干燥，得到低分子透明質(zhì)酸寡糖。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

19、（1）本發(fā)明的利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法，無需進(jìn)行菌體破碎，也無需進(jìn)行層析純化，對發(fā)酵后離心收集的菌泥僅需進(jìn)行一步重懸，即可獲得全細(xì)胞催化酶液，該全細(xì)胞催化酶液所用的菌體為重組大腸桿菌，可直接用于酶切大分子透明質(zhì)酸鈉，制備低分子量透明質(zhì)酸寡糖，包括不飽和透明質(zhì)酸二糖、不飽和透明質(zhì)酸四糖、不飽和透明質(zhì)酸六糖、不飽和透明質(zhì)酸八糖，完全降解后終產(chǎn)物為不飽和透明質(zhì)酸二糖；制備工藝簡單，成本較低，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；

20、（2）本發(fā)明的利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法，得到的低分子透明質(zhì)酸寡糖的外觀符合規(guī)定，含量為99.04-99.82%，平均相對分子量符合規(guī)定，溶液透光度為99.89-99.99%，干燥失重為3.11-4.31%，ph值為6.6-6.8，蛋白質(zhì)含量為0.03-0.04%。

技術(shù)特征：

1.一種利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法，其特征在于，包括：制備全細(xì)胞催化酶液，酶解反應(yīng)，后處理；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法，其特征在于，所述制備全細(xì)胞催化酶液中，菌泥重懸時的菌濃為1:8-12。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法，其特征在于，所述制備全細(xì)胞催化酶液中，所述重懸buffer的成分為：25mm磷酸鹽緩沖液，500mmnacl，ph為7.4。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法，其特征在于，所述酶解反應(yīng)中，所述全細(xì)胞催化酶液與純水的體積比為30-40:2000；

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法，其特征在于，所述后處理，包括：微濾，有機超濾膜分離，冷凍干燥。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法，其特征在于，所述微濾，對酶解液進(jìn)行微濾處理，得到微濾液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法，其特征在于，所述微濾中，微濾處理時使用的微濾裝置的制備方法為：將型號為335的紙板放入布氏漏斗，然后鋪一層硅藻土。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法，其特征在于，所述有機超濾膜分離，使用有機超濾膜對微濾液進(jìn)行分離，待透過液的固含量在5%以上時，收集透過液；

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法，其特征在于，所述冷凍干燥，對透過液進(jìn)行冷凍干燥，得到低分子透明質(zhì)酸寡糖。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種利用全細(xì)胞催化技術(shù)制備低分子透明質(zhì)酸寡糖的方法，其特征在于，包括：制備全細(xì)胞催化酶液，酶解反應(yīng)，后處理；所述制備全細(xì)胞催化酶液，將重組大腸桿菌菌泥按加入重懸Buffer進(jìn)行菌泥重懸，得到全細(xì)胞催化酶液；所述酶解反應(yīng)，將純水加熱至36?38℃，加入全細(xì)胞催化酶液、透明質(zhì)酸鈉底物，在密封條件下，在36?38℃下進(jìn)行酶解反應(yīng)，得到酶解液；本發(fā)明的方法無需進(jìn)行菌體破碎，無需進(jìn)行層析純化，發(fā)酵周期短，制備工藝簡單，成本較低，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：康傳利,褚洪官,史勁松,龔勁松,廉少杰,鄭德強,劉磊,杜帥,湯麗偉,張美霞,劉薔,趙玉雪
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5