本發(fā)明屬于基因編輯，具體涉及一種多基因堿基編輯載體及編輯方法和應用。

背景技術(shù)：

1、基因敲除是一種破壞目的基因正常序列，使該基因正常功能喪失的基因編輯技術(shù)。自從crispr/cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)，使得基因敲除操作更加簡單，成本逐漸降低，讓基因敲除系統(tǒng)在生物醫(yī)學領域的應用逐漸增加。在動物育種領域，基因敲除技術(shù)也有很大應用場景，已有研究表明敲除特定的基因可以增加豬的抗病性能，提高經(jīng)濟效益。由于優(yōu)良性狀通常是由多個基因控制，所以，對多基因的敲除對于育種具有重大意義。而想要多個基因同時進行編輯，其編輯效率還需進一步提高，尤其是對于想要得到多基因敲除的純合細胞系，因此提高多基因編輯效率對育種領域甚至農(nóng)業(yè)發(fā)展都是重要一環(huán)。目前運用的基因敲除效率主要是運用crispr/cas9系統(tǒng)對目標鏈進行剪切，產(chǎn)生雙鏈斷裂，進而利用細胞自身的修復系統(tǒng)使得修復后的雙鏈具有堿基的插入或缺失，產(chǎn)生移碼突變使得該基因功能喪失。但是雙鏈的斷裂會對細胞產(chǎn)生不良影響，可能會激活原癌基因，抑制抑癌基因等。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種多基因堿基編輯載體及編輯方法和應用，利用胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)，通過突變外顯子上的堿基，產(chǎn)生提前終止密碼子，造成多基因沉默，使得目標基因不能正常表達，同時避免產(chǎn)生雙鏈斷裂等危害。

2、本發(fā)明提供了一種多基因堿基編輯的載體，所述載體中包括串聯(lián)的復制子元件、u6啟動子和針對每個目標基因的sgrna；

3、其中每個u6啟動子啟動一個目標基因的sgrna序列的表達。

4、本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述復制子元件包括ebna1和orip。

5、本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述目標基因的數(shù)量不低于1個。

6、本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述目標基因包括與豬育種領域相關(guān)的基因和與豬品質(zhì)相關(guān)的基因。

7、本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述載體的骨架載體內(nèi)包括以下元件：單堿基編輯器、epi復制體元件和多u6串聯(lián)或csy4串聯(lián)。

8、本發(fā)明提供了一種多基因堿基編輯的串聯(lián)載體，包括去除上述載體中的復制子元件。

9、本發(fā)明的一個具體實施方式中，包括利用限制性內(nèi)切酶nhei和asci雙酶切所述載體。

10、本發(fā)明提供了一種靶向沉默多基因的方法，包括利用上述載體或利用上述串聯(lián)載體轉(zhuǎn)化至目標細胞中，得多基因沉默細胞。

11、本發(fā)明提供了利用上述方法構(gòu)建得到的多基因沉默細胞。

12、本發(fā)明提供了一種從上述多基因沉默細胞中篩選得到的多基因沉默純合細胞系。

13、有益效果：本發(fā)明提供了一種多基因堿基編輯的載體，通過利用復制子元件和u6及sgrna串聯(lián)的方式，可以使含復制子元件(epi元件)的質(zhì)粒在細胞中持續(xù)存在，進而使得質(zhì)粒上其它元件會在細胞內(nèi)持續(xù)表達，從而使得多基因產(chǎn)生基因沉默的效率提高。

14、本發(fā)明實施例中選擇豬育種領域的四個與抗病相關(guān)的基因(calr、anpep、cd163和antxr1)和一個與豬肉品質(zhì)相關(guān)的基因(mstn)進行基因沉默，利用復制子元件和每個基因的sgrna結(jié)合1個u6啟動子進行串聯(lián)的方式，構(gòu)建得到epibe4-5u6-sg載體。本發(fā)明還提供了一種串聯(lián)載體，即去除上述載體中的epi元件，實施例中構(gòu)建得到be4-5u6-sg載體。本發(fā)明實施例中構(gòu)建得到的兩種多基因編輯載體對靶向位點都有沉默編輯，其中epibe4-5u6-sg載體的編輯效率更高。本發(fā)明通過藥物富集篩選的方法，獲得5基因沉默的純合細胞系，為抗病育種提供了材料與方法。

技術(shù)特征：

1.一種多基因堿基編輯的載體，其特征在于，所述載體中包括串聯(lián)的復制子元件、u6啟動子和針對每個目標基因的sgrna；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述載體，其特征在于，所述復制子元件包括ebna1和orip。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述載體，其特征在于，所述目標基因的數(shù)量不低于1個。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述載體，其特征在于，所述目標基因包括與豬育種領域相關(guān)的基因和與豬品質(zhì)相關(guān)的基因。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述載體，其特征在于，所述載體的骨架載體內(nèi)包括以下元件：單堿基編輯器、epi復制體元件和多u6串聯(lián)或csy4串聯(lián)。

6.一種多基因堿基編輯的串聯(lián)載體，其特征在于，包括去除權(quán)利要求1～5任一項所述載體中的復制子元件。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述串聯(lián)載體，其特征在于，包括利用限制性內(nèi)切酶nhei和asci雙酶切所述載體。

8.一種靶向沉默多基因的方法，其特征在于，包括利用權(quán)利要求1～5任一項所述載體或利用權(quán)利要求6或7所述串聯(lián)載體轉(zhuǎn)化至目標細胞中，得多基因沉默細胞。

9.利用權(quán)利要求8所述方法構(gòu)建得到的多基因沉默細胞。

10.一種從權(quán)利要求8所述多基因沉默細胞中篩選得到的多基因沉默純合細胞系。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種多基因堿基編輯載體及編輯方法和應用，屬于基因編輯技術(shù)領域。本發(fā)明提供了一種多基因堿基編輯的載體，通過利用復制子元件和U6及sgRNA串聯(lián)的方式，可以使含復制子元件的質(zhì)粒在細胞中持續(xù)存在，進而使得質(zhì)粒上其它元件會在細胞內(nèi)持續(xù)表達，從而提高多基因沉默的效率。本發(fā)明還提供了一種串聯(lián)載體，即去除上述載體中的epi元件。本發(fā)明實施例中構(gòu)建得到的兩種多基因編輯載體對靶向位點都有沉默編輯作用，其中含epi元件的載體編輯效率更高。本發(fā)明通過藥物富集篩選的方法，獲得5基因沉默的純合細胞系，為抗病育種提供了材料與方法。

技術(shù)研發(fā)人員：李奎,黃雷,阮進學,李博
受保護的技術(shù)使用者：中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)基因組研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19