本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，特別是涉及基于電融合高效通過原核移植構(gòu)建的線粒體置換體系的方法。

背景技術(shù)：

1、線粒體是存在于真核生物除紅細(xì)胞以外所有細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一種細(xì)胞器，含有自身遺傳物質(zhì)，線粒體dna(mtdna)。受精卵中的mtdna突變可引起嚴(yán)重的母系遺傳疾病。自1988年兩例由不同mtdna位點突變引發(fā)的線粒體疾病被報道后，目前已有400多個致病位點突變被發(fā)現(xiàn)與線粒體疾病相關(guān)。研究數(shù)據(jù)顯示在西方每5000人中就有一人患有線粒體遺傳病，每200名新生兒中就有一名潛在的mtdna突變攜帶者，且至今尚無有效治療方法。近年來，線粒體置換(mr)作為一種新的治療策略已被用于將具有致病性線粒體的受精卵的核遺傳物質(zhì)(紡錘體、第一/第二極體和原核)轉(zhuǎn)移到健康的去核受精卵(重建受精卵)。在這種策略下，核遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移過程中，只會攜帶少量致病性線粒體到正常的去核受精卵中，隨著突變線粒體水平的降低，獲得的子代的生活質(zhì)量能夠得到改善。目前，相關(guān)研究和臨床前實驗已在小鼠、靈長類動物中廣泛進(jìn)行。

2、電融合促細(xì)胞間融合是一種安全、非病毒和非化學(xué)的方法，用于制備各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的雜交細(xì)胞，并且可以針對不同的細(xì)胞類型進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。這種方法的靈活性使得研究人員能夠根據(jù)特定的實驗需求，優(yōu)化電融合的參數(shù)，如電場強度、脈沖持續(xù)時間和頻率，從而實現(xiàn)最佳的細(xì)胞融合效果。此外，電融合技術(shù)的非侵入性特征意味著它不會引入外源性物質(zhì)，從而降低了對細(xì)胞的潛在損傷和不良反應(yīng)。這一優(yōu)勢使得電融合在細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)和基因工程等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。目前國內(nèi)通常使用滅活病毒以促進(jìn)致病性線粒體的受精卵的核遺傳物質(zhì)與健康去核受精卵進(jìn)行融合，相比之下融合時間更長，穩(wěn)定性更低。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供基于電融合高效通過原核移植構(gòu)建的線粒體置換體系的方法，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，使用電融合方法獲得通過原核移植構(gòu)建的線粒體置換體系，具有速度快，零污染，融合程度高，囊胚成活率高的特點。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供基于電融合高效通過原核移植構(gòu)建的線粒體置換體系的方法，包括體外將攜帶致病性線粒體的非人哺乳動物受精卵原核轉(zhuǎn)移到健康的非人哺乳動物去核受精卵中，通過電融合構(gòu)建線粒體置換體系的步驟。

4、優(yōu)選的是，所述非人哺乳動物為小鼠。

5、優(yōu)選的是，所述方法具體包括以下步驟：

6、通過顯微操作獲得攜帶致病性線粒體的小鼠受精卵的原核并舍棄細(xì)胞質(zhì)，作為配體；

7、通過顯微操作去除健康小鼠受精卵中的細(xì)胞核，獲取健康小鼠去核受精卵的胞漿，作為受體；

8、通過顯微注射技術(shù)將配體和受體進(jìn)行重構(gòu)，得到重組受精卵；

9、將所述重組受精卵置于ksom培養(yǎng)液中緩沖，之后再置于電融合液中平衡，調(diào)整重組受精卵與電極的相對位置后進(jìn)行電融合，獲取成功融合的重組受精卵，即得線粒體置換體系。

10、優(yōu)選的是，所述緩沖的時間為20-30min。

11、優(yōu)選的是，所述電融合液包括以下濃度的組分：0.28m甘露醇、0.1mm?cacl2、0.1mmmgso4和0.5mm?hepes緩沖液；

12、所述平衡的時間為2-5min。

13、優(yōu)選的是，所述調(diào)整重組受精卵與電極的相對位置的方法為：調(diào)整受精卵在電極中的位置，保證去核受精卵的胞漿和待植入的原核的中點連線與兩側(cè)電極線垂直。

14、優(yōu)選的是，所述電融合的參數(shù)包括：ac?10v，5s，dc?180v，40μs，1個循環(huán)。

15、本發(fā)明還提供一種線粒體置換小鼠模型的構(gòu)建方法，包括根據(jù)所述的方法構(gòu)建的線粒體置換體系，培養(yǎng)至囊胚階段，將發(fā)育成功的囊胚移入受體鼠，獲得線粒體置換小鼠模型。

16、優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)的條件為：37℃、5％?co2。

17、本發(fā)明還提供所述的方法構(gòu)建的線粒體置換體系或所述方法構(gòu)建的線粒體置換小鼠模型在研究線粒體遺傳病阻斷和治療的藥物中的應(yīng)用。

18、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

19、(1)可控性強：電融合過程可以通過調(diào)節(jié)電場強度和時間等參數(shù)進(jìn)行控制，從而實現(xiàn)對細(xì)胞融合效率的精確調(diào)節(jié)。

20、(2)簡化操作流程：與傳統(tǒng)的線粒體置換方法相比，電融合技術(shù)可以簡化操作流程，提高實驗的可重復(fù)性和效率。

21、(3)降低外源性污染風(fēng)險：電融合過程中不需要使用化學(xué)試劑，降低了外源性污染的風(fēng)險，確保了實驗結(jié)果的可靠性。

22、(4)高效的線粒體置換：通過電融合，可以實現(xiàn)高效的線粒體置換，確保重組細(xì)胞能夠獲得所需的健康線粒體，從而改善受精卵mtdna的異質(zhì)性水平。

23、(5)促進(jìn)細(xì)胞功能恢復(fù)：通過線粒體置換體系的構(gòu)建，能夠恢復(fù)受損細(xì)胞的功能，尤其是在一些線粒體疾病的治療中，具有重要的臨床意義。

技術(shù)特征：

1.基于電融合高效通過原核移植構(gòu)建的線粒體置換體系的方法，其特征在于，包括體外將攜帶致病性線粒體的非人哺乳動物受精卵原核轉(zhuǎn)移到健康的非人哺乳動物去核受精卵中，通過電融合構(gòu)建線粒體置換體系的步驟。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人哺乳動物為小鼠。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法具體包括以下步驟：

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述緩沖的時間為20-30min。

5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述電融合液包括以下濃度的組分：0.28m甘露醇、0.1mm?cacl2、0.1mm?mgso4和0.5mm?hepes緩沖液；

6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述調(diào)整重組受精卵與電極的相對位置的方法為：調(diào)整受精卵在電極中的位置，保證去核受精卵的胞漿和待植入的原核的中點連線與兩側(cè)電極線垂直。

7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述電融合的參數(shù)包括：ac?10v，5s，dc180v，40μs，1個循環(huán)。

8.一種線粒體置換小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的方法構(gòu)建的線粒體置換體系，培養(yǎng)至囊胚階段，將發(fā)育成功的囊胚移入受體鼠，獲得線粒體置換小鼠模型。

9.如權(quán)利要求8所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的條件為：37℃、5％co2。

10.如權(quán)利要求1-7任一項所述的方法構(gòu)建的線粒體置換體系或權(quán)利要求8-9任一項所述方法構(gòu)建的線粒體置換小鼠模型在研究線粒體遺傳病阻斷和治療的藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了基于電融合高效通過原核移植構(gòu)建的線粒體置換體系的方法，屬于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域。本發(fā)明選擇患有線粒體疾病的小鼠作為配體和健康的小鼠作為受體，配體細(xì)胞通過顯微操作獲得核供體原核并舍棄細(xì)胞質(zhì)，受體細(xì)胞通過顯微操作去除其受精卵的細(xì)胞核，獲得健康的去核胞漿。隨后通過顯微注射技術(shù)將提取的原核注入到受體細(xì)胞中，獲得重組受精卵，再通過電融合，形成線粒體置換體系。本發(fā)明在電融合的促進(jìn)下重組受精卵的總體融合效率達(dá)到90％以上，同時已融合的重組受精卵基本均可發(fā)育成成熟囊胚。本發(fā)明為阻斷線粒體疾病的傳遞與健康囊胚的構(gòu)建提供了新思路和新方法，可造福廣大線粒體遺傳病患者。

技術(shù)研發(fā)人員：紀(jì)冬梅,李欣媛,梁丹,張寧,何浩宇,王夢瑤,鄒薇薇,張智康,劉雅靜,曹云霞
受保護(hù)的技術(shù)使用者：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19