本發(fā)明屬于生物，具體涉及將目的蛋白定位于細胞膜表面的載體片段及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、claudin是一類由多基因家族編碼的四次跨膜蛋白，是形成細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的重要成分。claudin18是該家族成員之一，其編碼基因經(jīng)可變剪接可形成兩種亞型蛋白claudin18.1和claudin18.2。claudin18.1在正常和癌性肺組織中特異性表達，claudin18.2不表達在除胃粘膜以外的任何健康組織中，但在胃癌中廣泛表達，尤其是勞倫分型中的彌漫型。claudin18.2蛋白的n端和c端都位于細胞內(nèi)，整個蛋白表達于細胞膜上，是細胞緊密連接的重要結(jié)構(gòu)成分。

2、claudin18.2的臨床上的用途有多種：

3、1、是特異性單克隆抗體藥zolbetuximab伴隨診斷的靶點。

4、2、和cadherin-17聯(lián)用可以作為胃癌細胞檢測和定位的有效手段。

5、3、與胰腺癌、食道癌、和非小細胞肺癌治療相關(guān)。

6、液態(tài)細胞作為質(zhì)控品應(yīng)用于免疫組化染色，以消除實驗過程中的實驗誤差。但自然界中缺乏高表達claudin18.2的細胞，沒有天然細胞可作為質(zhì)控品，故需應(yīng)用基因改造技術(shù)構(gòu)建高表達claudin18.2的細胞，作為液態(tài)細胞質(zhì)控品的陽性對照。同時，claudin18.2作為胃癌檢測、診斷、治療熱門靶點，其過表達細胞株可作為診斷、治療研發(fā)中的材料。

7、由于claudin18.2為四次跨膜蛋白，受細胞表面積限制，其多次跨膜蛋白的表達量受到限制。同時，不像核定位信號（nls）可以將任意蛋白定位于細胞核，沒有公認的、高效率的膜定位信號將蛋白/多肽定位于細胞膜外。除去上述claudin18.2，還有其他可作為液態(tài)質(zhì)控品的膜蛋白，因此，提供一種特定的分子設(shè)計，高效快速地將目的蛋白定位于細胞膜表面，應(yīng)用于生產(chǎn)液態(tài)細胞質(zhì)控品是非常有必要的。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題中的一種，本發(fā)明提供了一種將目的蛋白定位于細胞膜表面的載體片段及其應(yīng)用，可實現(xiàn)高效快速地將蛋白/多肽定位于細胞膜表面，無需合成蛋白全長，縮減基因合成成本。

2、為了達到上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)手段：

3、本發(fā)明的第一方面提供了一種將目的蛋白定位于細胞膜表面的載體片段，包括claudin18.2?1-27aa序列，pdgfr膜定位序列，多克隆位點以及編碼目的蛋白的基因，多克隆位點位于claudin18.2?1-27aa序列和pdgfr膜定位序列之間，編碼目的蛋白的基因插入到多克隆位點中，所述claudin18.2?1-27aa序列的核苷酸序列如seq?id?no?.6所示。

4、在本發(fā)明的一些實施方案中，所述編碼目的蛋白的基因包括claudin18.2蛋白基因及muc-4蛋白基因。

5、在本發(fā)明的一些實施方案中，所述載體片段的兩端分別加入酶切位點ecori及bamhi序列。載體片段序列的兩端分別加入酶切位點ecori及bamhi序列，為克隆到慢病毒載體中提供酶切位點。

6、本發(fā)明的第二方面提供了一種編碼第一方面述載體片段的基因，編碼將claudin18.2蛋白定位于細胞膜表面的載體片段的基因的核苷酸序列如seq?id?no?.4，編碼將muc-4蛋白定位于細胞膜表面的載體片段的基因的核苷酸序列如seq?id?no?.5所示。

7、本發(fā)明的第三方面提供了一種慢病毒載體，包含第二方面所述的基因。在本發(fā)明的一些實施方案中，將合成的載體片段的基因根據(jù)酶切位點ecori及bamhi克隆到plv-cmv-mcs-ef1α-puro質(zhì)粒中。

8、在一些實施方案中，還包括將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α進行擴大培養(yǎng)的步驟。

9、本發(fā)明的第四方面提供了一種穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞池，所述細胞池的構(gòu)建方式為慢病毒方式、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方式或者細胞電轉(zhuǎn)化方式中的一種。

10、本發(fā)明的第五方面提供了第一方面所述的載體片段在作為將過表達的目的蛋白定位于細胞膜表面的載體工具中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明的第六方面提供了一種第一方面所述的載體片段作為將過表達的目的蛋白定位于細胞膜表面的載體工具在腫瘤藥物研究中的應(yīng)用。

12、本發(fā)明的第七方面提供了一種第一方面所述的載體片段作為將過表達的目的蛋白定位于細胞膜表面的載體工具在制備用于免疫檢測質(zhì)控品的工程細胞株中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一些實施方案中，免疫檢測質(zhì)控品為液態(tài)質(zhì)控品。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述液態(tài)質(zhì)控品用于細胞或組織的各種免疫檢測，包括但不限于免疫組化、免疫熒光、蛋白免疫印跡。

13、本發(fā)明的第八方面提供了一種將目的蛋白定位于細胞膜表面的方法，采用第一方面所述的載體片段作為細胞膜定位信號分子，將過表達的目的蛋白定位于細胞膜表面。

14、本發(fā)明的有益效果

15、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：多次跨膜蛋白受細胞表面積限制，無法達到高表達，如claudin18.2；個別膜蛋白雖為單次跨膜蛋白，但分子量巨大，做過表達基因合成成本高，如muc-4。本發(fā)明提供了一種可將過表達的目的蛋白定位于細胞膜上的載體片段，包括claudin18.2?1-27aa序列，pdgfr膜定位序列，多克隆位點以及編碼目的蛋白的基因，多克隆位點位于claudin18.2?1-27aa序列和pdgfr膜定位序列之間，編碼目的蛋白的基因插入到多克隆位點中。該結(jié)構(gòu)分子可高效快速地將目的蛋白片段定位于細胞膜表面，并且位于細胞膜外，實現(xiàn)包膜定位蛋白高表達，同時，也不需要合成蛋白全長，縮減基因合成成本；經(jīng)claudin18.2蛋白以及muc-4蛋白驗證，均可用于細胞池的構(gòu)建，還可用于液態(tài)細胞質(zhì)控品，其應(yīng)用包括但不限于細胞免疫組化、蛋白免疫印跡。

技術(shù)特征：

1.將目的蛋白定位于細胞膜表面的載體片段，其特征在于：包括claudin18.2?1-27aa序列，pdgfr膜定位序列，多克隆位點以及編碼目的蛋白的基因，多克隆位點位于claudin18.2?1-27aa序列和pdgfr膜定位序列之間，編碼目的蛋白的基因插入到多克隆位點中，所述claudin18.2?1-27aa序列的核苷酸序列如seq?id?no?.6所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的將目的蛋白定位于細胞膜表面的載體片段，其特征在于：所述編碼目的蛋白的基因包括claudin18.2蛋白基因及muc-4蛋白基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的將目的蛋白定位于細胞膜表面的載體片段，其特征在于：所述載體片段的兩端分別加入酶切位點ecori及bamhi序列。

4.編碼權(quán)利要求2所述載體片段的基因，其特征在于：編碼將claudin18.2蛋白定位于細胞膜表面的載體片段的基因的核苷酸序列如seq?id?no?.4，編碼將muc-4蛋白定位于細胞膜表面的載體片段的基因的核苷酸序列如seq?id?no?.5所示。

5.一種穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞池，其特征在于：含有權(quán)利要求1所述的載體片段。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞池，其特征在于：所述細胞池的構(gòu)建方式為慢病毒方式、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方式或者細胞電轉(zhuǎn)化方式中的一種。

7.一種權(quán)利要求1所述的載體片段在作為將過表達的目的蛋白定位于細胞膜表面的載體工具中的應(yīng)用。

8.一種權(quán)利要求1所述的載體片段作為將過表達的目的蛋白定位于細胞膜表面的載體工具在腫瘤藥物研究中的應(yīng)用。

9.一種權(quán)利要求1所述的載體片段作為將過表達的目的蛋白定位于細胞膜表面的載體工具在制備用于免疫檢測質(zhì)控品的工程細胞株中的應(yīng)用。

10.一種將目的蛋白定位于細胞膜表面的方法，其特征在于：采用權(quán)利要求1所述的載體片段作為細胞膜定位信號分子，將過表達的目的蛋白定位于細胞膜表面。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了將目的蛋白定位于細胞膜表面的載體，包括Claudin18.2?1?27aa序列，PDGFR膜定位序列，多克隆位點以及編碼目的蛋白的基因，多克隆位點位于Claudin18.2?1?27aa序列和PDGFR膜定位序列之間，編碼目的蛋白的基因插入到多克隆位點中，所述Claudin18.2?1?27aa序列的核苷酸序列如SEQ?ID?No.6所示。該載體片段的分子設(shè)計，可實現(xiàn)高效快速地將蛋白/多肽定位于細胞膜表面，無需合成蛋白全長，縮減基因合成成本，并且可應(yīng)用于生產(chǎn)液態(tài)細胞質(zhì)控品。

技術(shù)研發(fā)人員：黨南卯,王雅萍,張玲,李明振,蔡寧
受保護的技術(shù)使用者：杭州百凌生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19