本發(fā)明涉及生物高分子材料，具體涉及一種雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面的制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、癌癥即惡性腫瘤，是由于控制細(xì)胞分裂增殖機(jī)制失常而使得癌細(xì)胞無限增殖引發(fā)的疾病。癌細(xì)胞可以浸潤到腫瘤周圍的正常組織中，也可以通過體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到體內(nèi)其他組織，從而使病情失控，從腫瘤中釋放出來并通過外周血和淋巴系統(tǒng)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（ctc）是癌癥轉(zhuǎn)移的原因，準(zhǔn)確測定外周血中ctc的水平，可提供有價(jià)值的腫瘤信息，減少假陽性結(jié)果和降低侵襲性，因此對癌細(xì)胞進(jìn)行靶向性的捕獲及其重要。

2、目前現(xiàn)有技術(shù)中，利用ctc獨(dú)特的生物物理和生化特性以及納米技術(shù)的進(jìn)步，創(chuàng)造了各種精細(xì)材料表面，用于有效捕獲稀有ctc。然而，由于使用基于抗體的策略或缺乏選擇性的物理方法，目前已公開的的生物材料存在著對ctc捕獲能力低，捕獲后易釋放，生物材料易降解、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等問題，因此，制備一種穩(wěn)定、降解率低的生物材料，實(shí)現(xiàn)對癌細(xì)胞的選擇性高效捕獲及培養(yǎng)，具有良好的開發(fā)及應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面的制備方法，所述制備方法穩(wěn)定、高效、普適性及可重復(fù)性強(qiáng)。

2、本發(fā)明的第二個目的在于提供上述雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面的應(yīng)用，所述水凝膠表面能夠高效捕獲癌細(xì)胞，在生物醫(yī)學(xué)工程應(yīng)用廣泛，有良好的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

3、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

4、一種雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面，所述雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面的結(jié)構(gòu)為微米級蜂窩狀結(jié)構(gòu)，孔徑大小為21-32?μm；所述雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面由納米顆粒組成，納米顆粒的尺寸為400?nm-760?nm；所述雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面具有細(xì)胞印跡和適配體親和力協(xié)同作用。

5、進(jìn)一步地，所述適配體為適配體為多環(huán)dna。

6、一種上述雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面的制備方法，所述制備方法采用以下步驟：

7、（1）細(xì)胞模板的制備：培養(yǎng)癌細(xì)胞，洗滌，使用細(xì)胞固定液固定細(xì)胞在培養(yǎng)皿上，得到細(xì)胞模板；

8、（2）將單體、聚合物及引發(fā)劑溶解于去離子水中，將此混合溶液均勻滴加于步驟（1）制備的細(xì)胞模板之上，并在60℃條件下反應(yīng)2h以形成復(fù)合水凝膠；將所述復(fù)合水凝膠從模板上剝離，使用胰蛋白酶進(jìn)行處理，洗滌；將處理后的水凝膠置于氯化鈣溶液中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，洗滌后得到具有細(xì)胞印記的水凝膠模板。

9、（3）將步驟（2）中制得的具有細(xì)胞印記的水凝膠模板浸入多聚賴氨酸溶液中浸泡2小時，以確保模板表面得到充分修飾，對模板進(jìn)行徹底洗滌，去除未結(jié)合的多聚賴氨酸；將洗滌后的模板轉(zhuǎn)移至sulfo-nhs與edc的混合液中，進(jìn)行浸泡處理并再次洗滌，以促進(jìn)交聯(lián)反應(yīng)并清除殘留的化學(xué)試劑；利用cmd溶液均勻地覆蓋在模板的細(xì)胞印跡表面上，以進(jìn)一步穩(wěn)固印跡結(jié)構(gòu)；洗滌，制得具有雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面。

10、進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述培養(yǎng)癌細(xì)胞的密度至70-90%。

11、進(jìn)一步地，步驟（2）中，所述單體為丙烯酰胺（am）、丙烯酸（aa）、纖維素、環(huán)氧乙烷（eo）、甲基丙烯酸甲酯（mma）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（egdma）、丙烷或三氧化二銻；所述聚合物為聚丙烯（pp）、殼聚糖(cs)、聚碳酸酯（pc）、聚酰胺（pa）、聚乙烯醇（pva）或聚乙二醇（peg）；所述引發(fā)劑為過硫酸銨（aps）、n，n，n'，n'-四甲基乙二胺（temed）和過氧化氫（h2o2）中的一種或幾種；所述化合物單體、聚合物及引發(fā)劑的質(zhì)量比為1.8：（0.5-0.75）：0.0312。

12、進(jìn)一步地，步驟（2）中，所述氯化鈣溶液的濃度為0.5-1mol/l，交聯(lián)反應(yīng)的時間為0.5-1?h。

13、進(jìn)一步地，步驟（3）中，所述含有氨基或羧基官能團(tuán)聚合物為聚天冬氨酸（pasp）、膠原帶白、磷蛋白、血漿蛋白、聚d-賴氨酸(poly-d-lysine)或酪蛋白；所述聚合反應(yīng)在脫氧或真空環(huán)境中進(jìn)行，溫度為65-75℃，時間為0.5-2h。

14、進(jìn)一步地，步驟（3）中，所述cmd溶液的濃度為5-10?μg/ml，適配體溶液覆蓋細(xì)胞印跡表面的時間為0.5-1h；所述sulfo-nhs/edc混合物中sulfo-nhs與edc的濃度比為1：（2-3），其中sulfo-nhs的濃度為1?mg/ml；所述置于sulfo-nhs/edc混合物中浸泡的時間為1-2h；步驟（1）、步驟（2）、步驟（3）所述的洗滌均采用pbs進(jìn)行洗滌；步驟（2）所述胰蛋白酶的濃度為0.25%胰蛋白酶處理；步驟（1）所述的固定液為4%多聚甲醛（pfa）、70%乙醇或10%福爾馬林。

15、進(jìn)一步地，步驟（1）所述的癌細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞（mcf-7）、宮頸癌細(xì)胞（hela）、胃癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞或肝癌細(xì)胞。

16、一種上述雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面的應(yīng)用，所述水凝膠表面可應(yīng)用于ctc培養(yǎng)。

17、進(jìn)一步地，所述水凝膠表面可應(yīng)用于原發(fā)性腫瘤、ctc及轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行基因表達(dá)譜的比較或ctc不同表面標(biāo)志物表達(dá)的研究或ctc培養(yǎng)的藥物敏感性測試。

18、有益效果：（1）本發(fā)明提供了一種具有細(xì)胞印跡和適配體親和力協(xié)同作用的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面，通過在水凝膠中引入細(xì)胞印跡，能夠精準(zhǔn)匹配癌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)；通過在水凝膠中引入適配體，能夠靶向癌細(xì)胞；所述雙網(wǎng)絡(luò)（dn）水凝膠含有典型的微米級蜂窩結(jié)構(gòu)，孔徑大小為21-32?μm，這使其更加穩(wěn)定，且具有更低的降解率；且所述雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠由納米顆粒組成，納米顆粒的尺寸為400-760?nm，獨(dú)特的結(jié)構(gòu)組成使其可以精確匹配靶細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的高效捕獲和培養(yǎng)。

19、（2）本發(fā)明所提供的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面的制備方法穩(wěn)定、高效及可重復(fù)性強(qiáng)；此外本發(fā)明提供的制備方法具有普適性及可操作性強(qiáng)的特點(diǎn)，通過合理調(diào)控化合物的組成，能夠?qū)崿F(xiàn)對雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠改造，使其具有細(xì)胞印跡和適配體親和力，從而實(shí)現(xiàn)該方法的可控制備。

20、（3）本發(fā)明所提供的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面具有良好的粘附、生長和增殖能力，能夠高效捕獲癌細(xì)胞，對mcf-7和hela細(xì)胞的捕獲效率分別高達(dá)93±3%和90±2%，并且捕獲的癌細(xì)胞在水凝膠表面仍然具有較高的生存能力，在生物醫(yī)學(xué)工程應(yīng)用廣泛，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面的制備方法，其特征在于，所述制備方法采用以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1）中，所述培養(yǎng)癌細(xì)胞的密度至70-90%。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）中，所述單體為丙烯酰胺、丙烯酸、纖維素、環(huán)氧乙烷、甲基丙烯酸甲酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙烷或三氧化二銻；所述聚合物為聚丙烯、殼聚糖、聚碳酸酯、聚酰胺、聚乙烯醇或聚乙二醇；所述引發(fā)劑為過硫酸銨、n，n，n'，n'-四甲基乙二胺和過氧化氫中的一種或幾種；所述化合物單體、聚合物及引發(fā)劑的質(zhì)量比為1.8：（0.5-0.75）：0.0312。

4.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述氯化鈣溶液的濃度為0.5-1mol/l，交聯(lián)反應(yīng)的時間為0.5-1?h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3）中，所述含有氨基或羧基官能團(tuán)聚合物為聚d-賴氨酸、聚天冬氨酸、膠原蛋白、磷蛋白、血漿蛋白、聚d-賴氨酸或酪蛋白。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3）中，所述多環(huán)dna溶液為多環(huán)dna的pbs溶液，濃度為5-10?μg/ml，多環(huán)dna溶液覆蓋細(xì)胞印跡表面的時間為0.5-1h；所述sulfo-nhs/edc混合物中sulfo-nhs與edc的濃度比為1：（2-3），其中sulfo-nhs的濃度為1mg/ml；所述置于sulfo-nhs/edc混合物中浸泡的時間為1-2h；步驟（1）、步驟（2）、步驟（3）所述的洗滌均采用pbs進(jìn)行洗滌。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1）所述的癌細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞或肝癌細(xì)胞。

8.一種權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法制備的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面的應(yīng)用，其特征在于，所述水凝膠表面應(yīng)用于ctc培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述水凝膠表面可應(yīng)用于原發(fā)性腫瘤、ctc及轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行基因表達(dá)譜的比較或ctc不同表面標(biāo)志物表達(dá)的研究或ctc培養(yǎng)的藥物敏感性測試。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面的制備方法與應(yīng)用。所述雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠具有細(xì)胞印跡和適配體親和力協(xié)同作用，可以精確匹配靶細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對活靶細(xì)胞的高效捕獲和培養(yǎng)；穩(wěn)定性高、降解率低，且良好的粘附、生長和增殖能力。所述制備方法具有普適性及可操作性強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)水凝膠的可控制備；所述雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠對MCF?7和Hela細(xì)胞的捕獲效率分別高達(dá)93±3%和90±2%，且捕獲的癌細(xì)胞在水凝膠表面仍然具有較高的生存能力，有望應(yīng)用于CTC培養(yǎng)及其藥物敏感性個性化測試，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：陳東亮,楊大偉,任天瑩,李涵
受保護(hù)的技術(shù)使用者：聊城市人民醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10