本發(fā)明屬于植物基因工程，尤其涉及與棉花雄性不育性狀相關(guān)的ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，具有良好的雜種優(yōu)勢。利用雜種優(yōu)勢可以顯著提高棉花產(chǎn)量、抗逆能力、纖維品質(zhì)等，改善棉花的農(nóng)藝性狀。棉花的雜交制種中有三種方法和途徑，分別為通過細(xì)胞的雄性不育特性的三系法、利用雄性不育特性的兩系法以及人工授粉法。利用雄性不育系選育雜交種省去人工去雄的步驟，極大降低人工成本，因此創(chuàng)造出育性穩(wěn)定可靠的雄性不育系對棉花雜交育種極為必要。然而，現(xiàn)有的棉花雄性不育系仍存在一些問題，例如：育性不穩(wěn)定且敗育率不高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供與棉花雄性不育性狀相關(guān)的ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段及其應(yīng)用，利用crispr/cas9技術(shù)對ghcki基因啟動(dòng)子進(jìn)行改造，創(chuàng)制的缺失所述ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段的棉花雄性不育系具有育性穩(wěn)定且敗育率高的優(yōu)勢。

2、本發(fā)明提供了與棉花雄性育性性狀相關(guān)的ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段，核苷酸序列為：5'-atagtt-3'。

3、本發(fā)明還提供了上述方案所述ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段作為分子標(biāo)記在如下任一中的應(yīng)用：

4、1)創(chuàng)制棉花雄性不育系；

5、2)檢測或輔助檢測棉花的雄性育性，或制備用于檢測待測棉花是否為雄性不育系棉花的產(chǎn)品；

6、3)檢測待測棉花是否為雄性不育系，或制備用于檢測待測棉花是否為雄性不育系的產(chǎn)品；

7、4)檢測待測棉花是否為雄性不育系或待測棉花是否能用作雄性不育系，或制備用于檢測待測棉花是否為雄性不育系或待測棉花是否能用作雄性不育系的產(chǎn)品。

8、本發(fā)明還提供了用于檢測上述方案所述ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段在如下任一中的應(yīng)用：

9、1)創(chuàng)制棉花雄性不育系；

10、2)檢測或輔助檢測棉花的雄性育性，或制備用于檢測待測棉花是否為雄性不育系棉花的產(chǎn)品；

11、3)檢測待測棉花是否為雄性不育系，或制備用于檢測待測棉花是否為雄性不育系的產(chǎn)品；

12、4)檢測待測棉花是否為雄性不育系或待測棉花是否能用作雄性不育系，或制備用于檢測待測棉花是否為雄性不育系或待測棉花是否能用作雄性不育系的產(chǎn)品。

13、本發(fā)明還提供了與棉花雄性育性性狀相關(guān)的ghcki基因啟動(dòng)子突變體，核苷酸序列如seq?id?no.2～seq?id?no.4所示。

14、本發(fā)明還提供了一種抑制上述方案所述ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段表達(dá)的sgrna，核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

15、本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，以crispr/cas9載體為骨架質(zhì)粒，插入有上述方案所述的sgrna。

16、本發(fā)明還提供了上述方案所述的重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，將上述方案所述的sgrna通過多順反子trna-grna的方式連接至crispr/cas9載體上，得到所述重組表達(dá)載體。

17、本發(fā)明還提供了用于負(fù)調(diào)控上述方案所述的ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段的生物材料、所述的ghcki基因啟動(dòng)子突變體、所述的sgrna、所述的重組表達(dá)載體或所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的重組表達(dá)載體在創(chuàng)制棉花雄性不育系和/或棉花雜交育種中的應(yīng)用。

18、本發(fā)明還提供了一種創(chuàng)制棉花雄性不育系的方法，包括以下步驟：

19、將上述方案所述的重組表達(dá)載體或所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的重組表達(dá)載體通過轉(zhuǎn)基因的方式轉(zhuǎn)化至目標(biāo)棉花植株中，得到棉花雄性不育系。

20、本發(fā)明還提供了一種檢測或輔助檢測待測棉花的雄性育性的方法，包括如下步驟：

21、a1.檢測待測棉花的基因組中是否含有上述方案所述的ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段；

22、a2.根據(jù)步驟a1的檢測結(jié)果，按照如下標(biāo)準(zhǔn)確定所述待測棉花的雄性育性：若待測棉花的基因組中不含有所述ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段，則所述待測棉花雄性不育；若待測棉花的基因組中含有所述ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段，則所述待測棉花雄性可育。

23、本發(fā)明提供了與棉花雄性育性性狀相關(guān)的ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段，核苷酸序列為：5'-atagtt-3'。本發(fā)明的ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段為ghcki基因啟動(dòng)子區(qū)域一個(gè)tatabox片段，通過對該片段進(jìn)行敲除突變，可以創(chuàng)制出棉花雄性不育系。本發(fā)明利用crispr/cas9技術(shù)對ghcki基因啟動(dòng)子進(jìn)行改造，創(chuàng)制缺失上述方案所述ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段的棉花雄性不育系，可以有效解決現(xiàn)有棉花雄性不育系存在的育性不穩(wěn)定和敗育率低的問題。本發(fā)明通過精確編輯ghcki基因啟動(dòng)子區(qū)域tatabox片段，可以有效地抑制ghcki基因的表達(dá)，確保雄性不育系的育性穩(wěn)定。其次，本發(fā)明的ghcki基因啟動(dòng)子區(qū)域tatabox片段的缺失可以導(dǎo)致ghcki基因的表達(dá)水平顯著降低，從而提高雄性不育系的敗育率，減少人工輔助去雄的需求。此外，本發(fā)明創(chuàng)制的雄性不育系由單一基因控制，遺傳背景簡單，便于進(jìn)行遺傳改良和雜交育種。綜上，本發(fā)明基于所述ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段創(chuàng)制的棉花雄性不育系敗育率極高，為棉花雜交育種提供了重要的技術(shù)支持。

技術(shù)特征：

1.與棉花雄性育性性狀相關(guān)的ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段，其特征在于，核苷酸序列為：5'-atagtt-3'。

2.權(quán)利要求1所述ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段作為分子標(biāo)記在如下任一中的應(yīng)用：

3.用于檢測權(quán)利要求1所述ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段在如下任一中的應(yīng)用：

4.與棉花雄性育性性狀相關(guān)的ghcki基因啟動(dòng)子突變體，其特征在于，核苷酸序列如seq?id?no.2～seq?id?no.4所示。

5.一種抑制權(quán)利要求1所述ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段表達(dá)的sgrna，其特征在于，核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

6.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，以crispr/cas9載體為骨架質(zhì)粒，插入有權(quán)利要求4所述的sgrna。

7.權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，將權(quán)利要求5所述的sgrna通過多順反子trna-grna的方式連接至crispr/cas9載體上，得到所述重組表達(dá)載體。

8.用于負(fù)調(diào)控權(quán)利要求1所述的ghcki基因啟動(dòng)子缺失片段的生物材料、權(quán)利要求4所述的ghcki基因啟動(dòng)子突變體、權(quán)利要求5所述的sgrna、權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體或權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的重組表達(dá)載體在創(chuàng)制棉花雄性不育系和/或棉花雜交育種中的應(yīng)用。

9.一種創(chuàng)制棉花雄性不育系的方法，其特征在于，包括以下步驟：

10.一種檢測或輔助檢測待測棉花的雄性育性的方法，其特征在于，包括如下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了與棉花雄性不育性狀相關(guān)的GhCKI基因啟動(dòng)子缺失片段及其應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了與棉花雄性育性性狀相關(guān)的GhCKI基因啟動(dòng)子缺失片段，核苷酸序列為：5'?atagtt?3'。本發(fā)明利用CRISPR/Cas9技術(shù)對GhCKI基因啟動(dòng)子進(jìn)行改造，創(chuàng)制缺失所述GhCKI基因啟動(dòng)子缺失片段的棉花雄性不育系，可以有效解決現(xiàn)有棉花雄性不育系存在的育性不穩(wěn)定和敗育率低的問題。本發(fā)明基于所述GhCKI基因啟動(dòng)子缺失片段創(chuàng)制的棉花雄性不育系敗育率極高，為棉花雜交育種提供了重要的技術(shù)支持。

技術(shù)研發(fā)人員：閔玲,付一諾,李焱龍,馬歡歡,郭小平,朱龍付,張獻(xiàn)龍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26