本申請涉及生物醫(yī)藥，具體地，涉及一種測定重組人血管內(nèi)皮抑制素生物學(xué)活性的方法。

背景技術(shù)：

1、重組人血管內(nèi)皮抑制素是中國第一個抗血管生成靶向藥，用于治療初治或復(fù)治的ⅲ/ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者，顯示出良好的療效。而生物學(xué)活性是評價此類生物技術(shù)藥物有效性的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，是藥物在臨床前進(jìn)行質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。細(xì)胞測定試驗一般能較好地反映生物制品的生物學(xué)活性，常用于各種生物制品的活性測定。

2、目前已有的重組人血管內(nèi)皮抑制素生物學(xué)活性的測定方法是huvec細(xì)胞增殖抑制法，該方法采用原代huvec細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，細(xì)胞檢測代次限定在5代以內(nèi)。但是，與化學(xué)方法相比，生物活性測定方法因受生物因素的依賴表現(xiàn)為變異大的劣勢；而與使用傳代細(xì)胞相比較，使用原代細(xì)胞的方法變異更大。目前的重組人血管內(nèi)皮抑制素生物學(xué)活性的測定方法的檢測結(jié)果的穩(wěn)定性較差。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、提供了本申請以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷。需要一種測定重組人血管內(nèi)皮抑制素生物學(xué)活性的方法，基于特異性的s型曲線的抑制效果，能夠利用相對生物學(xué)活性的方法，得到待測重組人血管內(nèi)皮抑制素的生物學(xué)活性，變異較小，檢測結(jié)果穩(wěn)定。

2、本申請的第一方面，提供了一種測定重組人血管內(nèi)皮抑制素生物學(xué)活性的方法，所述方法包括：利用對l929細(xì)胞培養(yǎng)傳代后的傳代細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞與待測重組人血管內(nèi)皮抑制素進(jìn)行混合培養(yǎng)；對混合培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行裂解，得到裂解液；對裂解液進(jìn)行吸光度的測定，基于測定后的結(jié)果和人血管內(nèi)皮抑制素標(biāo)準(zhǔn)品與效應(yīng)細(xì)胞混合培養(yǎng)后的吸光度測定結(jié)果，利用相對生物學(xué)活性的方法，得到待測重組人血管內(nèi)皮抑制素的生物學(xué)活性。

3、本申請各個實施例提供的測定重組人血管內(nèi)皮抑制素生物學(xué)活性的方法，利用重組人血管內(nèi)皮抑制素可以抑制l929細(xì)胞培養(yǎng)傳代后的傳代細(xì)胞的增殖，且對l929細(xì)胞培養(yǎng)傳代后的傳代細(xì)胞具有專屬抑制性，其抑制性的濃度-吸光度曲線為s型曲線，能夠得到待測重組人血管內(nèi)皮抑制素的生物學(xué)活性，具有變異小的優(yōu)勢，且檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，實用性好。

技術(shù)特征：

1.一種測定重組人血管內(nèi)皮抑制素生物學(xué)活性的方法，其特征在于，所述方法包括：利用對l929細(xì)胞培養(yǎng)傳代后的傳代細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞與待測重組人血管內(nèi)皮抑制素進(jìn)行混合培養(yǎng)；對混合培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行裂解，得到裂解液；對裂解液進(jìn)行吸光度的測定，基于測定后的結(jié)果和人血管內(nèi)皮抑制素標(biāo)準(zhǔn)品與效應(yīng)細(xì)胞混合培養(yǎng)后的吸光度測定結(jié)果，利用相對生物學(xué)活性的方法，得到待測重組人血管內(nèi)皮抑制素的生物學(xué)活性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，效應(yīng)細(xì)胞與待測重組人血管內(nèi)皮抑制素進(jìn)行混合培養(yǎng)中，所述效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的接種密度為5000~15000個/培養(yǎng)單元。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，效應(yīng)細(xì)胞與待測重組人血管內(nèi)皮抑制素進(jìn)行混合培養(yǎng)中，培養(yǎng)孵育的時間為48~72小時。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，利用dmem培養(yǎng)基對l929細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代，所述dmem培養(yǎng)基含8-12%fbs、0.8-1.2%ps；培養(yǎng)傳代的溫度為30-40℃；在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)箱中的二氧化碳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4-6%。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，效應(yīng)細(xì)胞與待測重組人血管內(nèi)皮抑制素進(jìn)行混合培養(yǎng)，還包括：獲取待測重組人血管內(nèi)皮抑制素配制的不同濃度的待測重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液；不同濃度的待測重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液分別和效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得到不同濃度待測重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液分別對應(yīng)的培養(yǎng)后的培養(yǎng)物。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，對混合培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行裂解，得到細(xì)胞裂解液，包括：向不同濃度待測重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液分別對應(yīng)的培養(yǎng)后的培養(yǎng)物中加入染色液，并在加入染色液后孵育；染色孵育后，加入裂解劑，進(jìn)行裂解，得到不同濃度待測重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液分別對應(yīng)的裂解液。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，加入染色液后孵后培養(yǎng)孵育的時間為4-6h。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，對裂解液進(jìn)行吸光度的測定，基于測定后的結(jié)果利用相對生物學(xué)活性的方法，得到待測重組人血管內(nèi)皮抑制素的生物學(xué)活性，包括：對不同濃度待測重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液對應(yīng)的裂解液分別進(jìn)行吸光度測定，得到吸光度-濃度曲線；基于所述吸光度-濃度曲線進(jìn)行四參數(shù)曲線擬合，得到待測重組人血管內(nèi)皮抑制素的劑量效應(yīng)曲線；基于所述待測重組人血管內(nèi)皮抑制素的劑量效應(yīng)曲線和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的劑量效應(yīng)曲線，利用相對生物學(xué)活性的方法，得到待測重組人血管內(nèi)皮抑制素的生物學(xué)活性。

9.?根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，基于所述待測重組人血管內(nèi)皮抑制素的劑量效應(yīng)曲線和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的劑量效應(yīng)曲線，利用相對生物學(xué)活性的方法，得到待測重組人血管內(nèi)皮抑制素的生物學(xué)活性，包括，通過式（1）計算得到相對生物學(xué)活性，

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，待測重組人血管內(nèi)皮抑制素配制的不同濃度的待測重組人血管內(nèi)皮抑制素溶液的數(shù)量為8-10個。

技術(shù)總結(jié)
本申請實施例涉及一種測定重組人血管內(nèi)皮抑制素生物學(xué)活性的方法，利用L929細(xì)胞培養(yǎng)傳代后的傳代細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞與待測重組人血管內(nèi)皮抑制素進(jìn)行混合培養(yǎng)；對混合培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行裂解，得到裂解液；對裂解液進(jìn)行吸光度的測定，基于測定后的結(jié)果和人血管內(nèi)皮抑制素標(biāo)準(zhǔn)品與效應(yīng)細(xì)胞混合培養(yǎng)后，利用相對生物學(xué)活性的方法，得到待測重組人血管內(nèi)皮抑制素的生物學(xué)活性，本申請的方法利用抑制性的濃度?吸光度曲線為S型曲線，能夠得到待測重組人血管內(nèi)皮抑制素的生物學(xué)活性，檢測結(jié)果可靠。

技術(shù)研發(fā)人員：劉娜,趙艷霞,鄭鳳家,耿雪,蘇昕宇,祝清芬
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東省食品藥品檢驗研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10