本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，涉及一種基于免疫沉淀技術(shù)富集dna甲基化片段的方法。

背景技術(shù)：

1、dna甲基化一般指基因組cpg中胞嘧啶5號(hào)碳位的甲基化狀態(tài)。作為重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，在發(fā)育、疾病進(jìn)展中扮演著重要的作用。dna甲基化異常是癌癥發(fā)生和發(fā)展的重要早期事件。

2、在正常人類的dna中，2％～7％的胞嘧啶被甲基化，其中cpg是最重要的甲基化位點(diǎn)，它在基因組中呈現(xiàn)不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化區(qū)域。在基因組的某些區(qū)域，如基因的promoter(啟動(dòng)子區(qū))、5’utr(非翻譯區(qū))和第一個(gè)exon(外顯子)cpg的序列密度非常高。一般情況下，啟動(dòng)子區(qū)dna高甲基化與基因沉默相關(guān)，而低甲基化則與基因的活化相關(guān)聯(lián)。大量的研究表明，抑癌基因的失活與該基因的啟動(dòng)子區(qū)域cpg島過度甲基化有直接聯(lián)系，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。

3、針對(duì)基因組甲基化分析，目前主要是通過亞硫酸鹽處理的方式。采用重亞硫酸鹽處理樣本dna，將dna中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，經(jīng)pcr擴(kuò)增后進(jìn)一步變成胸腺嘧啶，而原本甲基化c則保持不變，從而有效的將表觀遺傳變異轉(zhuǎn)化為序列差異。但是，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法對(duì)dna處理的過程包括變性、脫氨基和脫磺酸基等步驟，dna先被變性成單鏈，然后經(jīng)高溫、高鹽、酸性、堿性環(huán)境，遭遇冰火兩重天，獲得的轉(zhuǎn)化dna的形態(tài)為單鏈為主，雙鏈混合，片段缺刻、缺口損傷、尿嘧啶狀態(tài)核苷酸。該過程一般會(huì)導(dǎo)致90％以上的dna模板丟失，大量的甲基化信息無法被后續(xù)流程檢測(cè)到。同時(shí)，該方法在堿基轉(zhuǎn)化處理時(shí)，存在序列轉(zhuǎn)化不完全或轉(zhuǎn)化過度的情況，從而產(chǎn)生人為偏倚，后續(xù)經(jīng)pcr擴(kuò)增會(huì)進(jìn)一步放大，造成大量的數(shù)據(jù)浪費(fèi)。為了降低偏倚發(fā)生，就需要投入更多的dna、降低pcr循環(huán)數(shù)并優(yōu)化pcr擴(kuò)增酶的效率。

4、甲基化dna免疫共沉淀技術(shù)(medip)的原理是由于哺乳動(dòng)物的甲基化通常發(fā)生在cpg的胞嘧啶5號(hào)碳原子(5mc)上，所以可以通過能特異性結(jié)合5mc的5-甲基胞嘧啶抗體來對(duì)高甲基化的片段進(jìn)行富集，而且由于5-甲基胞嘧啶抗體也可以對(duì)非cpg位點(diǎn)上的5mc進(jìn)行識(shí)別，因此具有更高的特異性，這種方法避免了傳統(tǒng)方法損失大，投入量多，數(shù)據(jù)浪費(fèi)等弊端。但目前在國(guó)內(nèi)尚無對(duì)應(yīng)的試劑盒出現(xiàn)，全部依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴，因此尋找優(yōu)化或替代性的方法是本領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種基于免疫沉淀技術(shù)富集dna甲基化片段的方法，包括如下步驟：

2、s1.向待測(cè)樣本中添加λdna作為dna甲基化保護(hù)劑，得到添加λdna的樣本；

3、s2.將免疫沉淀緩沖液和添加λdna的樣本混合后90-95℃孵育5-20min，結(jié)束后迅速冷卻，得到混合液；

4、s3.將抗體和磁珠加入到步驟s2得到的混合液中，2-8℃孵育4-16個(gè)小時(shí)；

5、s4.瞬時(shí)離心后置于預(yù)冷的磁力架上，棄掉上清液；使用洗滌液清洗磁珠；

6、s5.用洗脫液洗脫dna，條件為50-60℃/15min，95-100℃/15min。

7、優(yōu)選的，步驟s1中，dna甲基化保護(hù)劑中，甲基化λdna：非甲基化λdna的質(zhì)量比為1:1；

8、優(yōu)選的，添加λdna的樣本中，cfdna與dna甲基化保護(hù)劑的質(zhì)量比為1:10-1:40，其中cfdna的濃度不低于0.01ng/μl。

9、優(yōu)選的，步驟s2中，混合時(shí)，免疫沉淀緩沖液和添加λdna的樣本的體積比為(30-35)μl：(55-60)μl。

10、優(yōu)選的，步驟s2中，免疫沉淀緩沖液包括0.1-0.2m磷酸鈉溶液，1-2m氯化鈉溶液，1％-5％曲拉通x-100。

11、優(yōu)選的，步驟s3中，還包括磁珠的清洗步驟和抗體的稀釋步驟：

12、磁珠的清洗步驟：取2-6μl10mg/ml的磁珠原液用十倍稀釋的免疫沉淀緩沖液對(duì)磁珠進(jìn)行清洗，至少清洗兩次，最后一次采用20μl的十倍稀釋的免疫沉淀緩沖液重懸，得到濃度為1-3mg/ml的磁珠懸液；

13、抗體的稀釋步驟：將濃度為1mg/ml的5-甲基胞嘧啶抗體使用十倍稀釋的免疫沉淀緩沖液進(jìn)行10-100倍稀釋，得到抗體濃度為0.01-0.1mg/ml的溶液。

14、優(yōu)選的，步驟s3中，抗體、磁珠、步驟s2得到的混合液按照以下體積比混合：1:1:(15-20)。

15、優(yōu)選的，步驟s3中，磁珠為igg磁珠。

16、優(yōu)選的，步驟s3中，抗體為5-甲基胞嘧啶抗體。

17、優(yōu)選的，步驟s4中，洗滌液包括十倍稀釋的免疫沉淀緩沖液和高氯化鈉鹽濃度的免疫沉淀緩沖液；高氯化鈉鹽濃度的免疫沉淀緩沖液組分為0.01-0.02m磷酸鈉溶液，1-4m氯化鈉溶液，0.1％-0.5％曲拉通x-100。

18、優(yōu)選的，步驟s5中，洗脫液包括0.01-0.1m?tris-hcl、0.01-0.1m?edta、0.001-0.1％sds、0.1-1mg/ml蛋白酶k。

19、有益效果

20、本發(fā)明針對(duì)人外周血游離dna低起始量特性，通過優(yōu)化結(jié)合環(huán)境以及添加適量的修飾λdna作為dna甲基化保護(hù)劑，采用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的方式，減少由于抗體自身原因所帶來的非特異性結(jié)合，提高medip結(jié)合的特異性，降低非特異性。相對(duì)于bs方法，有效提高了甲基化基因的結(jié)合效率。本發(fā)明除了對(duì)外周血游離dna的高效特異甲基化片段富集產(chǎn)生了顯著效果之外，還同樣適用于臨床組織樣本如石蠟切片、癌組織等基因組dna的甲基化富集。

技術(shù)特征：

1.一種基于免疫沉淀技術(shù)富集dna甲基化片段的方法，包括如下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟s1中，dna甲基化保護(hù)劑中，甲基化λdna：非甲基化λdna的質(zhì)量比為1:1；

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟s2中，混合時(shí)，免疫沉淀緩沖液和添加λdna的樣本的體積比為(30-35)μl：(55-60)μl。

4.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟s3中，還包括磁珠的清洗步驟和抗體的稀釋步驟：

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟s3中，抗體、磁珠、步驟s2得到的混合液按照以下體積比混合：1:1:(15-20)。

6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟s3中，磁珠為igg磁珠。

7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟s3中，抗體為5-甲基胞嘧啶抗體。

8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，免疫沉淀緩沖液包括0.1-0.2m磷酸鈉溶液、1-2m氯化鈉溶液及1％-5％曲拉通x-100；

9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟s5中，洗脫液包括0.01-0.1m?tris-hcl、0.01-0.1m?edta、0.001-0.1％sds及0.1-1mg/ml蛋白酶k。

10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種基于免疫沉淀技術(shù)富集DNA甲基化片段的方法。本發(fā)明通過優(yōu)化磁珠?抗體?核酸結(jié)合環(huán)境以及添加適量的修飾λDNA作為DNA甲基化保護(hù)劑，采用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的方式，減少由于抗體自身原因所帶來的非特異性結(jié)合，優(yōu)化洗滌步驟，采用不同鹽離子濃度梯度洗滌磁珠抗體核酸結(jié)合物，降低非特異性富集，有效提高了甲基化基因的結(jié)合效率。

技術(shù)研發(fā)人員：王美叢,王冬旭,張笑笑,周旭建,萬佳渭,宮亞楠,謝偉娟,李維政
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江默樂生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10