本發(fā)明涉及基因工程和微生物，更具體的說是涉及一種基因工程菌及其在高產(chǎn)伊短菌素中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、芽孢桿菌是一種多功能生防細(xì)菌，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用。特別是在植物病蟲害的生物防治和增強(qiáng)作物的抗逆性方面表現(xiàn)出色。

2、伊短菌素(edeines)由四種非蛋白氨基酸殘基(β-tyr/β-phe、isoserine、dapa和dahaa)、一個甘氨酸和一個聚胺組成，包含四種組分(即edeine?a、b、d和f)，各組分又有α(a)和β(b)兩種同分異構(gòu)體，區(qū)別在于β-異絲氨酸(isoserine)中的羧基跟2,3-二氨基丙酸(dapa)中的α位氨基還是β位氨基形成肽鍵。伊短菌素對革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性菌、支原體和真菌都具有強(qiáng)烈抑菌活性，還具有免疫抑制活性。其作用方式與濃度密切有關(guān)，當(dāng)濃度小于15μg/ml時，它能抑制dna的合成，而當(dāng)濃度超過150μg/ml時，就變成了廣譜抑制劑(dna合成、蛋白質(zhì)翻譯和合成)。因此，伊短菌素具有開發(fā)為農(nóng)用或醫(yī)用抗生素的良好潛力。

3、野生型短短芽孢桿菌x23是煙草根際土壤分離到的廣譜拮抗細(xì)菌，但野生型x23菌株中edeines的產(chǎn)量較低，限制了其生防效果以及作為農(nóng)用抗生素的應(yīng)用。

4、因此，提供一種基因工程菌及其在高產(chǎn)伊短菌素中的應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種基因工程菌及其在高產(chǎn)伊短菌素中的應(yīng)用，該基因工程菌通過對短短芽孢桿菌進(jìn)行定向遺傳改造，能有效提高伊短菌素的產(chǎn)量。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種基因工程菌，以短短芽孢桿菌(brevibacillus?brevis)x23為原始菌株，敲除雙組份調(diào)控子liars；

4、所述雙組份調(diào)控子liars基因編號分別為a616_rs05710(sensorhistidinekinase)和a616_rs05715(response?regulatortranscription?factor)，核苷酸序列分別如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示。

5、進(jìn)一步，一種基因工程菌的構(gòu)建方法，具體步驟如下：

6、(1)利用liars的上下游同源臂、抗性基因和載體骨架，構(gòu)建同源重組敲除載體；

7、所述抗性基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；所述抗性基因是aprar；

8、所述liars的上游同源臂核苷酸序列如seq?id?no.12所示；下游同源臂核苷酸序列如seq?id?no.13所示；

9、所述載體骨架，以pe194質(zhì)粒為模板，引物pe194-f/pe194-r擴(kuò)增得到；

10、(2)利用同源重組技術(shù)將短短芽孢桿菌x23基因組中l(wèi)iars進(jìn)行組合敲除，得到基因工程菌。

11、進(jìn)一步，引物pe194-f/pe194-r序列如下：

12、pe194-f：cagctgcctcgcgcgtttcggtga；seq?id?no.6；

13、pe194-r：gttaagggatgcataaactgcatc；seq?id?no.7。

14、進(jìn)一步，所述的基因工程菌在高產(chǎn)伊短菌素中的應(yīng)用。

15、進(jìn)一步，所述的基因工程菌在抑制青枯菌中的應(yīng)用。

16、進(jìn)一步，所述的方法構(gòu)建的基因工程菌在高產(chǎn)伊短菌素中的應(yīng)用。

17、進(jìn)一步，所述的方法構(gòu)建的基因工程菌在抑制青枯菌中的應(yīng)用

18、經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明公開提供了一種基因工程菌及其在高產(chǎn)伊短菌素中的應(yīng)用，本發(fā)明通過構(gòu)建同源重組敲除載體，將野生型短短芽孢桿菌基因組中雙組份調(diào)控因子liars(基因編號號：a616_rs05710和a616_rs05715)進(jìn)行組合敲除，成功構(gòu)建了能夠高產(chǎn)伊短菌素的工程菌；本發(fā)明構(gòu)建的短短芽孢桿菌工程菌δliar/s，發(fā)酵后伊短菌素的產(chǎn)量與野生型短短芽孢桿菌x23相比分別提高了1.3倍；工程菌為實(shí)現(xiàn)伊短菌素在微生物源農(nóng)藥和醫(yī)藥中的開發(fā)與利用奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種基因工程菌，其特征在于，以短短芽孢桿菌(brevibacillus?brevis)x23為原始菌株，敲除雙組份調(diào)控子liars；

2.權(quán)利要求1所述的一種基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟如下：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，引物pe194-f/pe194-r序列如下：

4.權(quán)利要求1所述的基因工程菌在高產(chǎn)伊短菌素中的應(yīng)用。

5.權(quán)利要求1所述的基因工程菌在抑制青枯菌中的應(yīng)用。

6.權(quán)利要求2或3所述的方法構(gòu)建的基因工程菌在高產(chǎn)伊短菌素中的應(yīng)用。

7.權(quán)利要求2或3所述的方法構(gòu)建的基因工程菌在抑制青枯菌中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種基因工程菌及其在高產(chǎn)伊短菌素中的應(yīng)用，屬于基因工程和微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開的一種基因工程菌，以野生型短短芽孢桿菌X23為出發(fā)菌株，構(gòu)建雙組份調(diào)控因子LiaRS敲除載體，利用同源重組技術(shù)將野生型短短芽孢桿菌X23(X23?WT)中的雙組份調(diào)控因子LiaRS進(jìn)行敲除，得到相應(yīng)的高產(chǎn)伊短菌素的工程菌ΔliaR/S。通過本發(fā)明定向遺傳改造的基因工程菌能夠提高伊短菌素的產(chǎn)量，培養(yǎng)方式便捷、得率高，為實(shí)現(xiàn)伊短菌素在微生物源農(nóng)藥和醫(yī)藥中的開發(fā)與利用奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：劉天波,張亮,邱麗婷,陳武,張陽,滕凱,周向平,巢進(jìn),余貝,黃琪,段淑輝
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國煙草總公司湖南省公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10