本發(fā)明專(zhuān)利涉及一種用于定量檢測(cè)cho細(xì)胞dna片段大小分布的引物對(duì)及其應(yīng)用，屬于生物檢測(cè)。

背景技術(shù)：

1、在上市和臨床試驗(yàn)的生物藥中，70％來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系，其中，哺乳動(dòng)物cho細(xì)胞系是目前表達(dá)制備生物制品最廣泛的宿主細(xì)胞，近幾年仍將繼續(xù)作為生產(chǎn)生物制品的主要宿主細(xì)胞。生物制品(如疫苗、抗體藥物、基因藥物等)在制備過(guò)程中，多使用傳代細(xì)胞株進(jìn)行生產(chǎn)，嚴(yán)格的純化工藝可以去除一部分宿主細(xì)胞的dna片段，但產(chǎn)品中仍有可能會(huì)有殘留雜質(zhì)，這些宿主細(xì)胞殘留dna可能會(huì)傳遞腫瘤或病毒相關(guān)基因，存在潛在的危險(xiǎn)性。《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版第三部規(guī)定，康柏西普dna殘留量≤30pg/mg，重組乙型肝炎疫苗(cho細(xì)胞)dna殘留量應(yīng)不高于10pg/劑。因此，cho宿主細(xì)胞dna檢測(cè)項(xiàng)目是生物制品生產(chǎn)工藝中重要的質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)之一。

2、相關(guān)研究表明，基因的大小普遍在200bp以上，因此大于200bp的殘留dna片段可能會(huì)有一定的致病性，而且殘留dna片段越大，生物制品的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)越高。因此，各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)其提出了嚴(yán)格要求。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(fda)關(guān)于人類(lèi)基因治療新產(chǎn)品生產(chǎn)指導(dǎo)文件中明確指出hcd(宿主細(xì)胞dna)的片段要小于200bp；2022年5月，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品評(píng)審中心(cde)發(fā)布的《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》中也明確指出需對(duì)dna殘留量和殘留片段大小進(jìn)行控制，建議盡量將dna殘留片段的大小控制在200bp以下。因此，定量檢測(cè)使用cho宿主細(xì)胞表達(dá)抗體和重組蛋白，以及蛋白純化過(guò)程中cho宿主細(xì)胞殘留dna片段分布情況，有利于更好地對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，進(jìn)而降低生物制品中殘留的cho宿主細(xì)胞dna片段的致病性。

3、目前，市場(chǎng)上主要的分析殘留宿主細(xì)胞dna片段的方法是毛細(xì)管電泳的方法，研究者們開(kāi)發(fā)了一種基于毛細(xì)管凝膠電泳與敏感激光誘導(dǎo)熒光(cge-lif)檢測(cè)殘留dna分子大小的方法，可以檢測(cè)生物制品中殘留dna的大小。實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)宿主細(xì)胞殘留dna片段大小為50～2000bp。除了毛細(xì)管電泳法外，市場(chǎng)上還存在基于qpcr進(jìn)行生物制品中生產(chǎn)用細(xì)胞相關(guān)的dna片段檢測(cè)的試劑盒，相比于cge-lif操作更簡(jiǎn)單，耗時(shí)更短。

4、由于國(guó)內(nèi)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)于生物制品中宿主細(xì)胞dna的殘留量和殘留dna片段的大小分布等有強(qiáng)烈的關(guān)注，所以對(duì)cho細(xì)胞的殘留dna片段殘留量和殘留片段大小的檢測(cè)分析有著迫切的需求，但尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種用于定量檢測(cè)cho細(xì)胞dna片段大小分布的引物對(duì)。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

3、一種用于定量檢測(cè)cho細(xì)胞dna片段大小分布的引物對(duì)，至少包括以下描述的一組引物對(duì)：各引物對(duì)中的正向引物和反向引物分別特異性結(jié)合于seq?id?no:1所示區(qū)段，且其中一組引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在100bp以下，一組引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在100-199bp，一組引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在200-500bp，一組引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在500bp以上。

4、優(yōu)選的，所述引物對(duì)是指第一引物對(duì)、第二引物對(duì)、第三引物對(duì)或第四引物對(duì)；

5、其中第一引物對(duì)的正向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第113-156位；反向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第184-221位，并且所述引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-98bp；

6、第二引物對(duì)的正向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第101-156位；反向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第184-221位，并且所述引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為105-120bp；

7、第三引物對(duì)的正向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第101-156位；反向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第282-320位，并且所述引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為200-220bp；

8、第四引物對(duì)的正向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第37-153位；反向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第526-638位，并且所述引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為500-557bp。

9、優(yōu)選的，其中第一引物對(duì)包括seq?id?no:3所示的正向引物和seq?id?no:7所示的反向引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為92bp；

10、其中第二引物對(duì)包括seq?id?no:2所示的正向引物和seq?id?no:8所示的反向引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為115bp；

11、其中第三引物對(duì)包括seq?id?no:2所示的正向引物和seq?id?no:9所示的反向引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為204bp；

12、其中第四引物對(duì)包括seq?id?no:3所示的正向引物和seq?id?no:10所示的反向引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為511bp。

13、本發(fā)明還公開(kāi)了一種用于定量檢測(cè)cho細(xì)胞dna片段大小分布的引物對(duì)組合，包括所述的引物對(duì)中的至少三對(duì)，更優(yōu)選的，包括上述的第一引物對(duì)、第二引物對(duì)和第四引物對(duì)；或者上述的第一引物對(duì)、第三引物對(duì)和第四引物對(duì)；或者包括上述的第一引物對(duì)、第二引物對(duì)、第三引物對(duì)和第四引物對(duì)。

14、本發(fā)明還公開(kāi)了一種用于定量檢測(cè)cho細(xì)胞dna片段大小分布的試劑盒，包括上述的引物對(duì)或者引物對(duì)組合。

15、優(yōu)選的，還包括探針。

16、優(yōu)選的，所述探針的核苷酸序列如seq?id?no:15所示。

17、優(yōu)選的，所述探針一端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)fam，另一端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)bhq1。

18、試劑盒中還可以包括其他qpcr檢測(cè)所需的試劑，例如酶、buffer等等。

19、本發(fā)明還公開(kāi)了上述的引物對(duì)、引物對(duì)組合或上述的試劑盒在體外定量檢測(cè)cho細(xì)胞dna片段大小分布中的應(yīng)用。

20、本發(fā)明還公開(kāi)了一種定量檢測(cè)cho細(xì)胞dna片段大小分布的方法，以上述的引物對(duì)或引物對(duì)組合作為引物，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行qpcr，并檢測(cè)qpcr擴(kuò)增產(chǎn)物；或者采用上述的試劑盒，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行qpcr，并檢測(cè)qpcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

21、優(yōu)選的，待測(cè)樣品來(lái)自基于cho細(xì)胞基質(zhì)培育制備的疫苗、重組蛋白藥、抗體藥中的任意一種。

22、本發(fā)明的有益效果如下：

23、(1)本發(fā)明的目的是提供一種采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr(real-time?qpcr)技術(shù)定量檢測(cè)cho殘留dna片段的引物對(duì)及試劑，其能夠用于分析生物制品中間品、成品中的cho殘留dna片段，有利于改進(jìn)工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量，用于產(chǎn)品質(zhì)量控制和放行。

24、(2)利用所述引物探針的qpcr檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便快捷，從獲得樣品到給出檢測(cè)報(bào)告只需3h；靈敏度高，定量限均為3fg/μl；專(zhuān)屬性強(qiáng)，能區(qū)分小鼠基因組、e.coli、mdck細(xì)胞、hek293、vero細(xì)胞、畢赤酵母細(xì)胞等干擾性dna。

技術(shù)特征：

1.一種用于定量檢測(cè)cho細(xì)胞dna片段大小分布的引物對(duì)，其特征在于，至少包括以下描述的一組引物對(duì)：各引物對(duì)中的正向引物和反向引物分別特異性結(jié)合于seq?id?no:1所示區(qū)段，且其中一組引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在100bp以下，一組引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在100-199bp，一組引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在200-500bp，一組引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在500bp以上。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)是指第一引物對(duì)、第二引物對(duì)、第三引物對(duì)或第四引物對(duì)；

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物對(duì)，其特征在于，

4.一種用于定量檢測(cè)cho細(xì)胞dna片段大小分布的引物對(duì)組合，其特征在于，包括權(quán)利要求2或3中所述的引物對(duì)中的至少三對(duì)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所示的引物對(duì)組合，其特征在于，包括權(quán)利要求2或3中的第一引物對(duì)、第二引物對(duì)和第四引物對(duì)；或者包括權(quán)利要求2或3中所述的第一引物對(duì)、第三引物對(duì)和第四引物對(duì)；或者包括權(quán)利要求2或3中所述的第一引物對(duì)、第二引物對(duì)、第三引物對(duì)和第四引物對(duì)。

6.一種用于定量檢測(cè)cho細(xì)胞dna片段大小分布的試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引物對(duì)，或權(quán)利要求4或5所述的引物對(duì)組合。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括探針。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述探針的核苷酸序列如seq?id?no:15所示。

9.產(chǎn)品在體外定量檢測(cè)cho細(xì)胞dna片段大小分布中的應(yīng)用，其中產(chǎn)品是指權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引物對(duì)，或權(quán)利要求4或5所述的引物對(duì)組合，或權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的試劑盒。

10.一種定量檢測(cè)cho細(xì)胞dna片段大小分布的方法，其特征在于，以權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引物對(duì)或權(quán)利要求4或5中所述的引物對(duì)組合作為引物，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行qpcr，并檢測(cè)qpcr擴(kuò)增產(chǎn)物；或者采用權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的試劑盒，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行qpcr，并檢測(cè)qpcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種用于定量檢測(cè)CHO細(xì)胞DNA片段大小分布的引物對(duì)，至少包括以下描述的一組引物對(duì)：各引物對(duì)中的正向引物和反向引物分別特異性結(jié)合于SEQ?ID?NO:1所示區(qū)段，且其中一組引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在100bp以下，一組引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在100?199bp，一組引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在200?500bp，一組引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在500bp以上。本發(fā)明能夠用于分析生物制品中的CHO殘留DNA片段，有利于改進(jìn)工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量。利用所述引物對(duì)的PCR檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便快捷，從樣本獲取到檢測(cè)出結(jié)果只需3h；靈敏度高，定量限均為3fg/μL；專(zhuān)屬性強(qiáng)，能區(qū)分MDCK、E.coli等干擾性DNA。引物對(duì)組合能夠用于定量檢測(cè)生物制品中CHO殘留DNA片段大小分布情況。

技術(shù)研發(fā)人員：巫月,黃淑云
受保護(hù)的技術(shù)使用者：翌圣生物科技（上海）股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10