本發(fā)明涉及生物，特別涉及一種腸道感染致病菌快速檢測試劑盒及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、腸道致病菌感染引起的腸道傳染病因其發(fā)病率高，而成為危害人民身體健康的重要疾病。腸道致病菌主要有致瀉性大腸桿菌、霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、副溶血弧菌、輪狀病毒、諾如病毒等。

2、核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)指以擴(kuò)增dna或rna為手段，從而篩查特定基因的檢測技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、連接酶鏈反應(yīng)(lcr)、轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增反應(yīng)(tma)等。核酸檢測試劑是基于核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)的體外診斷試劑，目前已經(jīng)用于病原體檢測、特定疾病的早期診斷和體內(nèi)物質(zhì)的型別鑒定等。特別是最近幾年興起的多重?zé)晒鈖cr技術(shù)，該方法具有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，已廣泛用于基因表達(dá)研究、病原體檢測、基因分型等諸多領(lǐng)域。綜上，建立腸道感染致病菌的快速檢測方法對于預(yù)防和治療腸道感染致病菌感染都有很大必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)所存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種腸道感染致病菌快速檢測試劑盒及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明首次建立了同時(shí)檢測霍亂弧菌、致瀉性大腸埃希菌、志賀氏菌、輪狀病毒、諾如病毒的多重?zé)晒鈖cr試劑盒及其檢測方法，該方法具備高效、快速、高靈敏和特異性等優(yōu)點(diǎn)，可快速實(shí)現(xiàn)腸道感染致病菌的鑒定，具備較大的應(yīng)用前景。

2、本發(fā)明的首要目的是提供了一種快速檢測腸道感染致病菌的試劑盒，所述試劑盒包含同時(shí)檢測霍亂弧菌、致瀉性大腸埃希菌、志賀氏菌、輪狀病毒、諾如病毒的多重?zé)晒鈖cr試劑。

3、優(yōu)選地，所述多重?zé)晒鈖cr試劑中包括特異性擴(kuò)增引物和探針。

4、優(yōu)選地，特異性擴(kuò)增引物和探針序列依次如seq?id?no.1-15所示。

5、優(yōu)選地，所述多重?zé)晒鈖cr試劑還包括2×pcr?master?m?i?x、模板和/或ddh2o。

6、本發(fā)明的另一目的是提供了一種快速檢測腸道感染致病菌的多重?zé)晒鈖cr試劑，所述多重?zé)晒鈖cr試劑中包括同時(shí)檢測霍亂弧菌、致瀉性大腸埃希菌、志賀氏菌、輪狀病毒、諾如病毒特異性擴(kuò)增引物和探針。

7、優(yōu)選地，特異性擴(kuò)增引物序列依次如seq?id?no.1-15所示。

8、優(yōu)選地，所述多重?zé)晒鈖cr試劑還包括2×pcr?master?m?i?x、模板和/或ddh2o。

9、本發(fā)明的另一目的是提供了多重?zé)晒鈖cr試劑在制備檢測腸道感染致病菌的試劑盒中的用途，所述多重?zé)晒鈖cr試劑包括同時(shí)檢測霍亂弧菌、致瀉性大腸埃希菌、志賀氏菌、輪狀病毒、諾如病毒特異性擴(kuò)增引物和探針。

10、優(yōu)選地，特異性擴(kuò)增引物序列依次如seq?id?no.1-15所示。

11、優(yōu)選地，其特征在于，所述多重?zé)晒鈖cr試劑還包括2×pcr?master?m?i?x、模板和/或ddh2o。

12、本發(fā)明的另一方面在于還提供了一種非診斷目的的快速檢測腸道感染致病菌的檢測方法，所述方法包括如下步驟：

13、1)提取待測樣本總dna和總rna；

14、2)以所述總rna為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取總cdna；

15、3)將步驟1)獲得的總dna與步驟2)獲得的總cdna等體積混合均勻，制得模版dna；

16、4)以步驟3得到的模版dna為基礎(chǔ)，制備多重?zé)晒鈖cr反應(yīng)體系；

17、5)將多重?zé)晒鈖cr反應(yīng)體系置于熒光定量pcr檢測儀器中進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)，并收集記各通道的錄熒光信號。

18、優(yōu)選地，步驟2)中包括2×pcr?master?m?i?x?12μl、引物混合物4μl(400nm)、探針混合物2μl(200nm)、模板5μl，其余采用ddh2o補(bǔ)足至35μl。

19、優(yōu)選地，引物混合物分別等體積混合不同的檢測引物，并調(diào)整其終濃度為400nm；探針混合物分別等體積混合不同的檢測探針，并調(diào)整其終濃度為200nm。

20、優(yōu)選地，95℃3min；95℃30s、60℃45s，45個(gè)循環(huán)；于60℃檢測各個(gè)通道的熒光信號。

21、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：本發(fā)明首次建立了同時(shí)檢測霍亂弧菌、致瀉性大腸埃希菌、志賀氏菌、輪狀病毒、諾如病毒的多重?zé)晒鈖cr試劑盒及其檢測方法，該方法具備高效、快速、高靈敏和特異性等優(yōu)點(diǎn)，可快速實(shí)現(xiàn)腸道感染致病菌的鑒定，具備較大的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種快速檢測腸道感染致病菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含同時(shí)檢測霍亂弧菌、致瀉性大腸埃希菌、志賀氏菌、輪狀病毒、諾如病毒的多重?zé)晒鈖cr試劑；其中，所述多重?zé)晒鈖cr試劑中包括特異性擴(kuò)增引物和探針。

2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性擴(kuò)增引物和探針序列依次如seq?id?no.1-15所示。

3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述多重?zé)晒鈖cr試劑還包括2×pcrmaster?mix、模板和/或ddh2o。

4.一種快速檢測腸道感染致病菌的多重?zé)晒鈖cr試劑，其特征在于，所述多重?zé)晒鈖cr試劑中包括同時(shí)檢測霍亂弧菌、致瀉性大腸埃希菌、志賀氏菌、輪狀病毒、諾如病毒特異性擴(kuò)增引物和探針。

5.如權(quán)利要求4所述的試劑，其特征在于，所述特異性擴(kuò)增引物序列依次如seq?idno.1-15所示。

6.如權(quán)利要求4所述的試劑，其特征在于，所述多重?zé)晒鈖cr試劑還包括2×pcr?mastermix、模板和/或ddh2o。

7.權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的多重?zé)晒鈖cr試劑在制備檢測腸道感染致病菌的試劑盒中的用途。

8.一種非診斷目的的快速檢測腸道感染致病菌的檢測方法，所述方法包括如下步驟：

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟2)中包括2×pcr?master?mix?12μl、引物混合物4μl(400nm)、探針混合物2μl(200nm)、模板5μl，其余采用ddh2o補(bǔ)足至35μl；其中，引物混合物分別等體積混合不同的檢測引物，并調(diào)整其終濃度為400nm；探針混合物分別等體積混合不同的檢測探針，并調(diào)整其終濃度為200nm。

10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，多重pcr反應(yīng)程序包括：95℃3min；95℃30s、60℃45s，45個(gè)循環(huán)；于60℃檢測各個(gè)通道的熒光信號。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種腸道感染致病菌快速檢測試劑盒及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明首次建立了同時(shí)檢測霍亂弧菌、致瀉性大腸埃希菌、志賀氏菌、輪狀病毒、諾如病毒的多重?zé)晒釶CR試劑盒及其檢測方法，該方法具備高效、快速、高靈敏和特異性等優(yōu)點(diǎn)，可快速實(shí)現(xiàn)腸道感染致病菌的鑒定，具備較大的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：王泰華,史辛藝
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣東賽爾生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10