本申請(qǐng)涉及生物，具體涉及用于檢測(cè)隱孢子蟲的試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

1、隱孢子蟲（cryptosporidium）是一種重要的人獸共患腸道原蟲，其宿主范圍十分廣泛，可感染包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類等多種脊椎動(dòng)物，主要寄生于宿主胃腸道上皮細(xì)胞內(nèi)。目前，31個(gè)物種被認(rèn)為是有效的，較為常見的人獸共患蟲種有微小隱孢子蟲（c.?parvum）和人隱孢子蟲（c.?hominis）。隱孢子蟲多通過(guò)受污染的水源和食物等途徑傳播，由其感染可導(dǎo)致以腹瀉為主要臨床癥狀的人獸共患寄生蟲病，對(duì)人和動(dòng)物健康造成嚴(yán)重威脅。

2、隱孢子蟲的傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括糞便涂片鏡檢法、免疫學(xué)方法和核酸檢測(cè)方法。糞便涂片鏡檢法存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、特異性不強(qiáng)的缺點(diǎn)，且誤差較大，免疫學(xué)技術(shù)手段也存在靈敏性不足、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。在隱孢子蟲的核酸檢測(cè)方法中，絕大多數(shù)都是采用巢氏pcr（nested-pcr）經(jīng)過(guò)兩輪擴(kuò)增后進(jìn)行跑膠，操作過(guò)程相對(duì)繁瑣，時(shí)間約需4-5小時(shí)，而且容易污染。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，本申請(qǐng)一實(shí)施方式有必要提供一種靈敏度高和特異性好的用于檢測(cè)隱孢子蟲的引物對(duì)、crrna反應(yīng)試劑；基于此，還提供一種隱孢子蟲的檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏且特異性好，操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短。

2、技術(shù)方案包括如下：

3、用于檢測(cè)隱孢子蟲的引物對(duì)，所述引物對(duì)包括序列如seq?id?no：3~4所示的引物。

4、用于檢測(cè)隱孢子蟲的crrna，所述crrna包括序列如seq?id?no：5所示的crrna。

5、用于檢測(cè)隱孢子蟲的反應(yīng)試劑，所述反應(yīng)試劑包括rpa擴(kuò)增反應(yīng)試劑和crispr檢測(cè)反應(yīng)試劑；所述rpa擴(kuò)增反應(yīng)試劑包括所述的引物對(duì)，所述crispr檢測(cè)反應(yīng)試劑包括所述的crrna。

6、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述rpa擴(kuò)增反應(yīng)試劑還包括rpa反應(yīng)微球和用于溶解微球的溶解劑中的一種或者多種。

7、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述crispr檢測(cè)反應(yīng)試劑還包括cas12a酶、crispr反應(yīng)緩沖液和ssdna熒光報(bào)告探針中的一種或者多種。

8、用于檢測(cè)隱孢子蟲的試劑盒，包括所述的引物對(duì)、所述的crrna或所述的反應(yīng)試劑。

9、所述的引物對(duì)、所述的crrna或所述的反應(yīng)試劑在制備檢測(cè)隱孢子蟲的試劑盒中的用途。

10、隱孢子蟲的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

11、以dna為模版，利用所述的引物對(duì)進(jìn)行rpa恒溫?cái)U(kuò)增；

12、以所得的rpa擴(kuò)增產(chǎn)物為模版，加入所定義的crispr檢測(cè)反應(yīng)試劑進(jìn)行crispr反應(yīng)，檢測(cè)熒光信號(hào)；以及

13、根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷待測(cè)樣本是否含有隱孢子蟲。

14、在其中一個(gè)實(shí)施例中，rpa恒溫?cái)U(kuò)增滿足如下條件中的一個(gè)或多個(gè)：

15、（1）在rpa恒溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中，每條引物的濃度為0.3μm~1μm；?以及，

16、（2）rpa恒溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)條件包括溫度為40℃~45℃，時(shí)間為15min~30min。

17、在其中一個(gè)實(shí)施例中，crispr反應(yīng)滿足如下條件中的一個(gè)或多個(gè)：

18、（1）在crispr反應(yīng)體系中，所述的crrna、cas12a酶蛋白和ssdna熒光報(bào)告探針的濃度分別為5nm~10nm、0.2μm?~1μm和0.2μm?~1μm；以及，

19、（2）crispr反應(yīng)條件包括溫度為36℃~38℃，時(shí)間為22min~30min。

20、相對(duì)于傳統(tǒng)技術(shù)，本申請(qǐng)具備如下有益效果：

21、利用本申請(qǐng)的引物以及crrna檢測(cè)隱孢子蟲具有靈敏度高特異性好等優(yōu)點(diǎn)；基于該引物以及crrna建立的隱孢子蟲的檢測(cè)方法同樣具有高靈敏和高特異性，且反應(yīng)時(shí)間短，單份核酸樣本在1小時(shí)內(nèi)可出檢測(cè)結(jié)果，與國(guó)標(biāo)巢氏pcr方法相比可縮短5小時(shí)；此外，跟實(shí)時(shí)熒光pcr方法比較，反應(yīng)過(guò)程在40-45度的恒溫區(qū)間即可完成，對(duì)檢測(cè)設(shè)備的要求較低。

技術(shù)特征：

1.用于檢測(cè)隱孢子蟲的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)包括序列如seq?id?no：3~4所示的引物。

2.用于檢測(cè)隱孢子蟲的crrna，其特征在于，所述crrna包括序列如seq?id?no：5所示的crrna。

3.用于檢測(cè)隱孢子蟲的反應(yīng)試劑，其特征在于，所述反應(yīng)試劑包括rpa擴(kuò)增反應(yīng)試劑和crispr檢測(cè)反應(yīng)試劑；

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的反應(yīng)試劑，其特征在于，所述rpa擴(kuò)增反應(yīng)試劑還包括rpa反應(yīng)微球和用于溶解微球的溶解劑中的一種或者多種。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的反應(yīng)試劑，其特征在于，所述crispr檢測(cè)反應(yīng)試劑還包括cas12a酶、crispr反應(yīng)緩沖液和ssdna熒光報(bào)告探針中的一種或者多種。

6.用于檢測(cè)隱孢子蟲的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的引物對(duì)、權(quán)利要求2所述的crrna或權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)試劑。

7.權(quán)利要求1所述的引物對(duì)、權(quán)利要求2所述的crrna或權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)試劑在制備檢測(cè)隱孢子蟲的試劑盒中的用途。

8.隱孢子蟲的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于，rpa恒溫?cái)U(kuò)增滿足如下條件中的一個(gè)或多個(gè)：

10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的檢測(cè)方法，其特征在于，crispr反應(yīng)滿足如下條件中的一個(gè)或多個(gè)：

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)涉及用于檢測(cè)隱孢子蟲的試劑盒及方法。本申請(qǐng)?zhí)峁┯糜跈z測(cè)隱孢子蟲的引物對(duì)、crRNA以及試劑盒，基于該引物、crRNA以及試劑盒構(gòu)建的隱孢子蟲的檢測(cè)方法同樣具有高靈敏和高特異性，且反應(yīng)時(shí)間短，單份核酸樣本在1小時(shí)內(nèi)可出檢測(cè)結(jié)果，與國(guó)標(biāo)巢氏PCR方法相比可縮短5小時(shí)。

技術(shù)研發(fā)人員：辛本強(qiáng),李俊強(qiáng),董瑞玲,陳琛,劉君,盧峰,李東曉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：深圳國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心（深圳海關(guān)口岸門診部）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10