本發(fā)明屬于芽孢誘導(dǎo)萌發(fā)領(lǐng)域，具體涉及一種芽孢誘導(dǎo)萌發(fā)劑及其在促進(jìn)凝結(jié)海恩德里克斯氏菌芽孢萌發(fā)生長(zhǎng)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、凝結(jié)海恩德里克斯氏菌（heyndrickxia?coagulans）原名凝結(jié)芽胞桿菌（bacilluscoagulans），是一種兼具乳酸菌和芽孢桿菌雙重功效的兼性厭氧革蘭氏陽(yáng)性菌，既能產(chǎn)乳酸又產(chǎn)芽孢，且與其他益生菌相比，具有更強(qiáng)的抗逆性、耐高溫、胃酸和膽鹽能力。研究表明凝結(jié)海恩德里克斯氏菌有調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)動(dòng)物消化吸收、免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性，被稱作益生菌之王和動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑，我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2013年將其正式列入《飼料添加劑品種目錄》，作為抗生素替代品廣泛應(yīng)用于包括水產(chǎn)養(yǎng)殖、蛋雞蛋鴨、肉雞肉鴨與斷奶仔豬的畜禽飼糧中。

2、凝結(jié)海恩德里克斯氏菌在外界環(huán)境適宜、營(yíng)養(yǎng)豐富時(shí)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖；若遇極端條件或營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)則誘導(dǎo)芽孢產(chǎn)生。芽孢能夠耐受飼料制粒工藝、胃液等極端條件，較營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞更易保存，是菌劑的主要應(yīng)用形式，但菌劑只有在腸道內(nèi)萌發(fā)為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞時(shí)才能生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物如?l-乳酸、凝固素等物質(zhì)發(fā)揮益生菌活性。凝結(jié)海恩德里克斯氏菌在胃腸道的存活率很高，但腸道內(nèi)芽孢萌發(fā)率卻低于10%。研究表明，凝結(jié)海恩德里克斯氏菌芽孢在萌發(fā)劑(agfk)、d-果糖、l-天冬酰胺等芽孢桿菌屬常用的萌發(fā)因子作用下，萌發(fā)率低于70%。因此尋找一種有效的萌發(fā)劑提高凝結(jié)海恩德里克斯氏菌的萌發(fā)率對(duì)其生產(chǎn)應(yīng)用中最大限度地發(fā)揮益生菌功效具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)凝結(jié)海恩德里克斯氏菌芽孢萌發(fā)率低的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種芽孢誘導(dǎo)萌發(fā)劑及其在促進(jìn)凝結(jié)海恩德里克斯氏菌芽孢萌發(fā)生長(zhǎng)中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明芽孢誘導(dǎo)萌發(fā)劑，包括如下組分：

3、d-葡萄糖30-100mmol/l，海藻糖30-100?mmol/l，l-丙氨酸50-100?mmol/l，肌苷50-100?mmol/l，ca2+-dpa30-100?mmol/l（30-100?mmol/l?cacl2，30-100?mmol/l?dpa）。

4、所述芽孢誘導(dǎo)萌發(fā)劑以10?mmol/l?tris-hcl和10?mmol/l?nacl作為復(fù)配溶劑。

5、本發(fā)明芽孢誘導(dǎo)萌發(fā)劑在促進(jìn)凝結(jié)海恩德里克斯氏菌芽孢萌發(fā)生長(zhǎng)中的應(yīng)用。

6、包括以下步驟：

7、步驟1：芽孢的收集和純化

8、1-1、將凝結(jié)海恩德里克斯氏菌在bc固體培養(yǎng)基上劃線，40℃培養(yǎng)24小時(shí)后挑取單菌落轉(zhuǎn)移至bc液體培養(yǎng)基中，并在40℃，180?r/min條件下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。

9、1-2、以1-5%的接種量將凝結(jié)海恩德里克斯氏菌菌液轉(zhuǎn)接到產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，40℃，180?r/min條件下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后厭氧培養(yǎng)48小時(shí)。當(dāng)芽孢轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%以上時(shí)，于4℃，8000?r/min離心10?min收集芽孢。

10、通過(guò)孔雀石綠染色法評(píng)價(jià)芽孢轉(zhuǎn)化率，具體方法是滴加一滴無(wú)菌水于潔凈載玻片上，挑菌涂布，干燥，經(jīng)火焰來(lái)回20次熱固定，飽和孔雀石綠室溫下覆蓋染色15min以上，水洗，石炭酸復(fù)紅染液覆蓋1~2min，水洗，干燥后顯微鏡觀察。

11、1-3、為了獲得100%純度的芽孢，將芽孢懸液浸于80℃水浴15分鐘，以去除營(yíng)養(yǎng)體和正在萌發(fā)的細(xì)胞，為了有效去除培養(yǎng)基殘?jiān)图?xì)胞碎片，用預(yù)冷的滅菌后的超純水反復(fù)洗三次來(lái)純化芽孢。將純化的芽孢調(diào)節(jié)濃度至?108?cfu/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

12、步驟2：芽孢萌發(fā)

13、用滅菌水將芽孢懸浮液吸光度調(diào)至od600nm≈1.0，轉(zhuǎn)移至60-75℃水浴10-20min后冷卻至室溫，8000?r/min離心2?min后加入所述芽孢誘導(dǎo)萌發(fā)劑（體積1ml：1ml），轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱，于40-45℃、150-200?r/min振蕩培養(yǎng)1-3h。檢測(cè)芽孢懸浮液在600?nm時(shí)的吸光值，檢測(cè)前將試管搖動(dòng)至少30s，使芽孢均勻分布。

14、本發(fā)明操作簡(jiǎn)單易行，關(guān)鍵技術(shù)在于孢子萌發(fā)劑的制備、水浴熱激活以及孢子萌發(fā)，使凝結(jié)海恩德里克斯氏菌的芽孢萌發(fā)率提高到95%，為凝結(jié)海恩德里克斯氏菌的萌發(fā)及萌發(fā)后發(fā)揮益生功效提供理論基礎(chǔ)。本發(fā)明中的萌發(fā)劑可用于畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖中促進(jìn)凝結(jié)海恩德里克斯氏菌芽孢的快速萌發(fā)，有效發(fā)揮益生菌功效。

技術(shù)特征：

1.一種芽孢誘導(dǎo)萌發(fā)劑，其特征在于包括如下組分：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芽孢誘導(dǎo)萌發(fā)劑，其特征在于：

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的芽孢誘導(dǎo)萌發(fā)劑，其特征在于包括如下組分：

4.權(quán)利要求1或2所述芽孢誘導(dǎo)萌發(fā)劑在促進(jìn)凝結(jié)海恩德里克斯氏菌芽孢萌發(fā)生長(zhǎng)中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種芽孢誘導(dǎo)萌發(fā)劑及其在促進(jìn)凝結(jié)海恩德里克斯氏菌芽孢萌發(fā)生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其中芽孢誘導(dǎo)萌發(fā)劑包括如下組分：D?葡萄糖30?100mmol/L，海藻糖30?100?mmol/L，L?丙氨酸50?100?mmol/L，肌苷50?100?mmol/L，Ca<supgt;2+</supgt;?DPA?30?100?mmol/L。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單易行，關(guān)鍵技術(shù)在于孢子萌發(fā)劑的制備、水浴熱激活以及孢子萌發(fā)，使凝結(jié)海恩德里克斯氏菌的芽孢萌發(fā)率提高到95%，為凝結(jié)海恩德里克斯氏菌的萌發(fā)及萌發(fā)后發(fā)揮益生功效提供理論基礎(chǔ)。本發(fā)明中的萌發(fā)劑可用于畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖中促進(jìn)凝結(jié)海恩德里克斯氏菌芽孢的快速萌發(fā)，有效發(fā)揮益生菌功效。

技術(shù)研發(fā)人員：劉姣姣,劉祚軍,章雪蘋,焦鄭同,尹強(qiáng)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)機(jī)械裝備與工程研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17