本發(fā)明屬于農(nóng)作物分子育種，具體涉及一種利用基因編輯技術提高油菜種子大小和粒重的方法。

背景技術：

1、油菜，是十字花科植物，屬蕓薹屬不同種，營養(yǎng)價值豐富。目前油菜主要栽培類型為：白菜型油菜、芥菜型油菜和甘藍型油菜。油菜是世界上最重要的油料作物之一，是人類食用油的重要來源。

2、我國油料作物種植規(guī)模僅次于糧食作物，油料產(chǎn)品的穩(wěn)定生產(chǎn)和有效供應為國民食品安全和人民福祉提供了重要保障(王漢中等2014)。而油菜種子大小不僅作為重要的經(jīng)濟性狀，也是作物產(chǎn)量的決定因素之一(li?et?al?2016，li?et?al2021)；決定油菜產(chǎn)量的三要素分別是油菜的種子大小與重量、角果粒數(shù)、每株角果數(shù)(fu?et?al?2015，王杰利2016)。因此，通過對調(diào)控甘藍型油菜種子大小相關基因功能的研究，對油菜產(chǎn)量的提升和培育高產(chǎn)的油菜品種而言迫在眉睫。

3、研究發(fā)現(xiàn)，bnaa9.rsl是通過fox-hunting技術篩選到與油菜種子大小和含油量密切相關的基因。但是，目前尚未見基于甘藍型油菜種子中bnarsl功能缺失提高種子大小與重量的報道。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種利用crispr/cas9基因編輯技術對甘藍型油菜bnarsl三個拷貝進行基因編輯，從而獲得種子大小和粒重增加的甘藍型油菜種質的方法。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種利用基因編輯技術提高油菜種子大小和粒重的方法，包括以下步驟：

3、(1)在甘藍型油菜bnarsl核苷酸序列相似程度高的位置篩選靶點序列，并設計相對應的靶點引物；所述bnarsl包括bnaa9rsl、bnac5rsl、bnaa10rsl三個拷貝基因，其核苷酸序列分別如seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3所示；

4、(2)利用所述靶點引物，構建用于所述甘藍型油菜定向編輯的crispr/cas9重組載體pbnarsl；

5、(3)將所述pbnarsl載體轉化甘藍型油菜，進而獲得種子大小和粒重增加的油菜株系。

6、在一優(yōu)選的實施方式中，步驟(1)中，經(jīng)篩選的所述靶點序列包括s1和s2，其核苷酸序列分別如seq?id?no.4、seq?id?no.5所示。

7、在一優(yōu)選的實施方式中，步驟(1)中，設計的所述靶點引物包括：

8、對應于所述靶點s1的靶點引物的核苷酸序列如seq?id?no.6和seq?idno.7所示；

9、對應于所述靶點s2的靶點引物的核苷酸序列如seq?id?no.8和seq?idno.9所示。

10、在一優(yōu)選的實施方式中，步驟(2)中，所述構建用于所述甘藍型油菜定向編輯的crispr/cas9重組載體pbnarsl，具體包括以下步驟：

11、將設計的所述靶點引物與sgrna靶標表達盒連接；

12、對不同sgrna靶標表達盒進行擴增；

13、將所述sgrna靶標表達盒與基因編輯載體crispr/cas9?p35sphse401進行酶切連接。

14、在一優(yōu)選的實施方式中，步驟(3)中，將所述pbnarsl載體轉化甘藍型油菜的方法包括：利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法進行轉化。

15、本發(fā)明的目的在于提供由上述任意一項方法選育的種子大小和粒重提高的油菜種質。

16、本發(fā)明的另一目的在于利用上述任意一項基因編輯技術提高油菜種子大小和粒重的方法在油菜育種領域的應用。

17、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的技術方案具有如下優(yōu)點：

18、本發(fā)明利用基因編輯技術突變甘藍型油菜的bnarsl的三個拷貝bnaa9rsl、bnac5rsl和bnaa10rsl，通過在三個拷貝核苷酸序列相似程度高的位置篩選了2個靶點序列，并設計相應的靶點序列引物進一步構建用于甘藍型油菜三個拷貝定向編輯的重組載體pbnarsl，并利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法轉化甘藍型油菜，從而獲得種子大小與重量顯著增加的株系。

19、采用本發(fā)明提供的方法可以顯著提高油菜種子的大小與重量，為油菜高產(chǎn)育種提供新的種質和方法。尤其在油菜育種領域具備良好的應用前景。

技術特征：

1.一種利用基因編輯技術提高油菜種子大小和粒重的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權利要求1所述利用基因編輯技術提高油菜種子大小和粒重的方法，其特征在于，步驟(1)中，經(jīng)篩選的所述靶點序列包括s1和s2，其核苷酸序列分別如seq?id?no.4、seq?idno.5所示。

3.如權利要求1所述利用基因編輯技術提高油菜種子大小和粒重的方法，其特征在于，步驟(1)中，設計的所述靶點引物包括：

4.如權利要求1所述利用基因編輯技術提高油菜種子大小和粒重的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述構建用于所述甘藍型油菜定向編輯的crispr/cas9重組載體pbnarsl，具體包括以下步驟：

5.如權利要求1所述利用基因編輯技術提高油菜種子大小和粒重的方法，其特征在于，步驟(3)中，將所述pbnarsl載體轉化甘藍型油菜的方法包括：利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法進行轉化。

6.如權利要求1-5任意一項所述方法選育的種子大小和粒重提高的油菜種質。

7.如權利要求1-5任意一項所述利用基因編輯技術提高油菜種子大小和粒重的方法在油菜育種領域的應用。

技術總結
本發(fā)明提供了一種利用基因編輯技術提高油菜種子大小和粒重的方法及其應用，涉及農(nóng)作物分子育種技術領域。具體包括以下步驟：(1)在甘藍型油菜BnaRSL核苷酸序列相似程度高的位置篩選靶點序列，并設計相對應的靶點引物；所述BnaRSL包括BnaA9RSL、BnaC5RSL、BnaA10RSL三個拷貝基因，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?No.1、SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.3所示；(2)利用所述靶點引物，構建用于所述甘藍型油菜定向編輯的CRISPR/Cas9重組載體pBnaRSL；(3)將所述pBnaRSL載體轉化甘藍型油菜，進而獲得油菜種子大小和粒重提高的株系。本發(fā)明提供的方法可以顯著增加油菜種子的大小與重量，為油菜高產(chǎn)育種提供新的種質和方法，具備良好的應用前景。

技術研發(fā)人員：劉超,張椿雨,王芳,陳鵬,孫雪雨,劉鈺蓮
受保護的技術使用者：華中農(nóng)業(yè)大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/17