本發(fā)明屬于植物分子育種，具體涉及一種調(diào)控多年生黑麥草株型的lpbpm5.6基因、低表達(dá)載體、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、株型是植物重要的農(nóng)藝性狀，調(diào)控分蘗、葉夾角以及根等的基因可通過(guò)改善株型的方式顯著提高水稻oryza?sativa、玉米zea?mays、小麥triticum?aestivum等作物的產(chǎn)量。與谷物等作物分蘗少、莖葉直立的“理想株型”明顯不同，矮株高、多分蘗、莖葉匍匐生長(zhǎng)是草坪用草的“理想株型”。

2、黑麥草lolium?perenne?l.，多年生禾本科植物，根系發(fā)達(dá)，須根較多，在15厘米～20厘米的土層中呈網(wǎng)狀分布，這有助于其更好地吸收土壤中的水分和養(yǎng)分。莖稈直立，中空，叢生，質(zhì)地柔軟，高80厘米-100厘米，具節(jié)間，且分蘗較多，這使得黑麥草能夠快速地形成茂密的草叢，同時(shí)具有分蘗能力強(qiáng)、成坪速度快、綠期長(zhǎng)等特點(diǎn)，常用于觀賞綠化和高爾夫場(chǎng)球道建植。

3、現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于調(diào)控禾本科植物株型的基因，主要是通過(guò)參與植物激素途徑，如：與赤霉素生物合成途徑相關(guān)的dwarf1、dwarf3、dwarf8和dwarf11等；與油菜素內(nèi)酯生物合成途徑相關(guān)的brd1、nana?plant1和nana?plant2等；與生長(zhǎng)素生物合成途徑相關(guān)的breviesplant1和pin1等。這些基因多見(jiàn)于玉米、水稻和小麥中，參與株型的形態(tài)建成；而對(duì)于調(diào)控多年生黑麥草株型的基因，目前尚未有報(bào)道。

4、綜上所述，急需提供一個(gè)調(diào)控多年生黑麥草株型的基因，使多年生黑麥草呈現(xiàn)“理想株型”。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種調(diào)控多年生黑麥草株型的lpbpm5.6基因、低表達(dá)載體、構(gòu)建方法及其應(yīng)用，lpbpm5.6的低表達(dá)水平使多年生黑麥草呈現(xiàn)出矮株高、多分蘗、少須根的株型，這為草坪草株型改良提供良好應(yīng)用。

2、本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種調(diào)控株型的多年生黑麥草lpbpm5.6基因，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

3、本發(fā)明提供了一種利用多年生黑麥草lpbpm5.6基因構(gòu)建的低表達(dá)載體，包括以下步驟：

4、提取多年生黑麥草葉片rna，反轉(zhuǎn)錄得到cdna；合成一對(duì)引物，以cdna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到attb-pcr產(chǎn)物，引物序列如seq?id?no.4和seq?id?no.5所示；將attb-pcr產(chǎn)物與供體載體混合，加入bp重組混合酶孵育，終止，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，獲得gateway系統(tǒng)的入門載體；將入門載體和表達(dá)載體混合，加入lr重組克隆酶孵育，終止，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，獲得低表達(dá)載體。

5、優(yōu)選地，所述供體載體為pdona207，所述表達(dá)載體為pc336。

6、本發(fā)明還提供了一種利用多年生黑麥草lpbpm5.6基因或者所述的低表達(dá)載體在調(diào)控多年生黑麥草株型中的應(yīng)用。

7、所述低表達(dá)載體用于制備低表達(dá)lpbpm5.6的多年生黑麥草植株，制備過(guò)程包括以下步驟：

8、將所述低表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性重組根癌農(nóng)桿菌；陽(yáng)性重組根癌農(nóng)桿菌侵染多年生黑麥草愈傷組織，在共培養(yǎng)基上黑暗共培養(yǎng)；黑暗共培養(yǎng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至抗性培養(yǎng)基，篩選陽(yáng)性多年生黑麥草愈傷組織；將陽(yáng)性多年生黑麥草愈傷組織依次轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基，獲得低表達(dá)lpbpm5.6的多年生黑麥草植株。

9、優(yōu)選地，所述根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞為eha105、gv3101和lb4404中的任意一種。

10、優(yōu)選地，所述侵染的過(guò)程為：在1.0×105pa～1.5×105pa將多年生黑麥草愈傷組織浸泡在陽(yáng)性重組根癌農(nóng)桿菌懸液中20min，隨后80rpm～80rpm孵育20min～25min。

11、優(yōu)選地，所述分化培養(yǎng)基的配方為：每升ms培養(yǎng)基中加入0.5mg～0.6mg芐氨基嘌呤、30g～32g麥芽糖、3g～4g植物凝膠和150mg～152mg特美汀。

12、優(yōu)選地，所述壯苗培養(yǎng)基的配方為：每升ms培養(yǎng)基中加入30g～32g麥芽糖、3g～4g植物凝膠和150mg～152mg特美汀。

13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明首次克隆了一個(gè)調(diào)控多年生黑麥草株型的基因全長(zhǎng)序列，即lpbpm5.6。lpbpm5.6作為一個(gè)調(diào)控多年生黑麥草株型的基因，可使多年生黑麥草呈現(xiàn)“理想株型”。

14、發(fā)明人通過(guò)構(gòu)建lpbpm5.6低表達(dá)載體，獲得低表達(dá)lpbpm5.6基因的黑麥草植株。結(jié)果表明，與野生型多年生黑麥草相比，該基因低表達(dá)后，可使多年生黑麥草分蘗數(shù)增加20％以上，株高和鮮重降低一半以上，并且須根明顯減少，這些性狀的明顯改變?yōu)槎嗄晟邴湶莸炔萜翰葜晷透牧继峁┲巍?/p>

技術(shù)特征：

1.一種調(diào)控株型的多年生黑麥草lpbpm5.6基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq?idno.1所示。

2.一種利用權(quán)利要求1所述的多年生黑麥草lpbpm5.6基因構(gòu)建的低表達(dá)載體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的低表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于，所述供體載體為pdona207，所述表達(dá)載體為pc336。

5.利用權(quán)利要求1所述的多年生黑麥草lpbpm5.6基因或者權(quán)利要求2所述的低表達(dá)載體在調(diào)控多年生黑麥草株型中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述低表達(dá)載體用于制備低表達(dá)lpbpm5.6的多年生黑麥草植株，制備過(guò)程包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞為eha105、gv3101和lb4404中的任意一種。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述侵染的過(guò)程為：

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述分化培養(yǎng)基的配方為：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于植物分子育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控多年生黑麥草株型的LpBPM5.6基因、低表達(dá)載體、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。一種調(diào)控株型的多年生黑麥草LpBPM5.6基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明首次克隆了一個(gè)調(diào)控多年生黑麥草株型的基因全長(zhǎng)序列，即LpBPM5.6。LpBPM5.6作為一個(gè)調(diào)控多年生黑麥草株型的基因，可使多年生黑麥草呈現(xiàn)“理想株型”。發(fā)明人通過(guò)構(gòu)建LpBPM5.6低表達(dá)載體，獲得低表達(dá)LpBPM5.6基因的黑麥草植株。結(jié)果表明，與野生型多年生黑麥草相比，該基因低表達(dá)后，可使多年生黑麥草分蘗數(shù)增加20％以上，株高和鮮重降低一半以上，并且須根明顯減少，這些性狀的明顯改變?yōu)槎嗄晟邴湶莸炔萜翰葜晷透牧继峁┲巍?br/>
技術(shù)研發(fā)人員：秦濤,強(qiáng)治全,苗翠翠
受保護(hù)的技術(shù)使用者：西北農(nóng)林科技大學(xué)深圳研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10