本發(fā)明涉及一種稻原生質(zhì)體緩沖液及應(yīng)用，屬于原生質(zhì)體制備。

背景技術(shù)：

1、植物的細(xì)胞具有細(xì)胞壁，富含果膠，并連接相鄰的細(xì)胞。每個(gè)細(xì)胞的活細(xì)胞質(zhì)，以質(zhì)膜為界，構(gòu)成原生質(zhì)體。通常，細(xì)胞膜(質(zhì)膜)和細(xì)胞壁之間保持密切接觸，因?yàn)樵撃⑴c壁合成。然而，在高滲溶液中，細(xì)胞的質(zhì)膜從其壁收縮。隨后去除細(xì)胞壁后會(huì)釋放出大量球形、滲透壓脆弱的原生質(zhì)體(“naked”細(xì)胞)，其中質(zhì)膜是細(xì)胞質(zhì)與其直接外部環(huán)境之間的唯一屏障。

2、植物原生質(zhì)體已被確立為一種通用的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，其應(yīng)用范圍廣泛，特別適用于植物生物化學(xué)與分子機(jī)制的研究領(lǐng)域。該系統(tǒng)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞壁合成以及蛋白質(zhì)分泌等關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程中展現(xiàn)出了顯著的應(yīng)用價(jià)值?；谠|(zhì)體的實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系，涵蓋了亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子活性分析、離子吸收實(shí)驗(yàn)、原生質(zhì)體再生體系建立、遠(yuǎn)源雜交及蛋白質(zhì)相互作用驗(yàn)證等多方面的研究方法，為植物科學(xué)領(lǐng)域的研究提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支持。

3、但是，稻的原生質(zhì)體在制備過(guò)程中通常配方過(guò)于復(fù)雜，配置過(guò)程繁瑣、影響稻的原生質(zhì)體的進(jìn)一步研究。

4、因此，提供一種簡(jiǎn)易的稻原生質(zhì)體緩沖液及應(yīng)用，提高配置簡(jiǎn)易程度，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決稻的原生質(zhì)體在制備過(guò)程中通常配方過(guò)于復(fù)雜，配置過(guò)程繁瑣的問(wèn)題，本發(fā)明的目的之一是提供一種稻原生質(zhì)體緩沖液，所述緩沖液每1000ml包括：9±0.45g的氯化鈉(nacl)、18.35±0.9g的二水氯化鈣(cacl2·2h2o)、8±0.4ml摩爾濃度為0.2m的2-嗎啉乙磺酸溶液(mes溶液)、0.447±0.02g的氯化鉀(kcl)，并使用ddh2o定容至1000ml，得到的稻原生質(zhì)體緩沖液命名為h-t緩沖液。

2、優(yōu)選的，所述mes溶液的ph為5.7。

3、本發(fā)明的另一目的是提供一種稻原生質(zhì)體的制備方法，具體步驟如下所述：

4、(1)取稻的組織部位制備成薄片置于ml酶解液中避光培養(yǎng)。

5、(2)用200目的篩將ml酶解液過(guò)濾，棄去含ml酶解液的濾液得到組織薄片。

6、(3)用h-t緩沖液懸浮步驟(2)得到薄片，并在避光培養(yǎng)后過(guò)100目疊200目篩子，薄片殘留在篩子上，收集濾液，將濾液離心，除去上清，保留沉淀。

7、(4)用h-t緩沖液沖洗殘留在篩子上的薄片，收集沖洗過(guò)薄片的h-t緩沖液，離心，去除上清，保留沉淀。

8、(5)步驟(3)和步驟(4)得到沉淀混合后離心，棄去上清保留沉淀，在沉淀中加入h-t緩沖液混合均勻，得到9311初始原生質(zhì)體重懸液。

9、優(yōu)選的，步驟(1)中所述ml酶解液由ml酶解液ⅰ和ml酶解液ⅱ按體積比1:1的比例混合得到，其中ml酶解液ⅰ中包括：1.0g的纖維素酶r10、0.5g的離析酶r10、5ml摩爾濃度為0.2m的2-嗎啉乙磺酸溶液，最后用摩爾濃度為0.6m的d-甘露醇溶液補(bǔ)足至100ml；ml酶解液ⅱ中包括：100μl濃度為1m的cacl2，0.1g牛血清白蛋白，用ddh2o補(bǔ)足至100ml。

10、優(yōu)選的，步驟(1)中避光培養(yǎng)的條件為：在28℃，轉(zhuǎn)速為80rpm的搖床上培養(yǎng)4h。

11、優(yōu)選的，步驟(3)中避光培養(yǎng)的條件為：在28℃，轉(zhuǎn)速為80rpm的搖床上培養(yǎng)2h。

12、優(yōu)選的，步驟(4)用h-t緩沖液沖洗殘留在篩子上的薄片4次，每次用20mlh-t緩沖液，將每次沖洗完薄片的緩沖液分別收集后離心，并保留沉淀。

13、優(yōu)選的，步驟(3)、步驟(4)和步驟(5)中離心條件為：1200rpm離心6min，升速與降速為3。

14、本發(fā)明的有益效果

15、(1)本發(fā)明所述h-t緩沖液的優(yōu)勢(shì)在于成分簡(jiǎn)單、配置簡(jiǎn)單、步驟簡(jiǎn)化、提取范圍廣。

16、(2)使用本發(fā)明所述h-t緩沖液制備得到的原生質(zhì)體完整度較高，提取得到的原生質(zhì)體數(shù)量更多。

技術(shù)特征：

1.一種稻原生質(zhì)體緩沖液，其特征在于：所述緩沖液每1000ml包括：9±0.45g的氯化鈉、18.35±0.9g的二水氯化鈣、8±0.4ml摩爾濃度為0.2m的2-嗎啉乙磺酸溶液、0.447±0.02g的氯化鉀，并使用ddh2o定容至1000ml，得到的稻原生質(zhì)體緩沖液命名為h-t緩沖液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述稻原生質(zhì)體緩沖液，其特征在于：所述2-嗎啉乙磺酸溶液的ph為5.7。

3.權(quán)利要求1所述稻原生質(zhì)體緩沖液在制備稻原生質(zhì)體中的應(yīng)用，其特征在于：具體包括如下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟(1)中所述ml酶解液由ml酶解液ⅰ和ml酶解液ⅱ按體積比1:1的比例混合得到，其中ml酶解液ⅰ包括：1.0g的纖維素酶r10、0.5g的離析酶r10、5ml摩爾濃度為0.2m的2-嗎啉乙磺酸溶液，最后用摩爾濃度為0.6m的d-甘露醇溶液補(bǔ)足至100ml；ml酶解液ⅱ包括：100μl濃度為1m的cacl2，0.1g牛血清白蛋白，用ddh2o補(bǔ)足至100ml。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟(1)中避光培養(yǎng)的條件為：在28℃，轉(zhuǎn)速為80rpm的搖床上培養(yǎng)4h。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟(3)中避光培養(yǎng)的條件為：在28℃，轉(zhuǎn)速為80rpm的搖床上培養(yǎng)2h。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟(3)、步驟(4)和步驟(5)中離心條件為：1200rpm離心6min，升速與降速為3。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種稻原生質(zhì)體緩沖液及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)提出一種H?T緩沖液及其使用方法，使水稻原生質(zhì)體提取過(guò)程中需要W5緩沖液緩釋及MMG溶液重懸的步驟簡(jiǎn)化；H?T緩沖液兼容W5緩釋及MMG溶液重懸的功能，使用本發(fā)明所述H?T緩沖液不僅節(jié)省了制備原生質(zhì)體的時(shí)間，并且制備得到的原生質(zhì)體質(zhì)量更好。

技術(shù)研發(fā)人員：胡鳳益,王善文,廉小平,張石來(lái)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：云南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10