本發(fā)明涉及生物，尤其涉及鑒定pw1801菠菜雜交種純度的ssr引物及方法。

背景技術(shù)：

1、菠菜為莧科藜亞科菠菜屬，是一種以綠葉與嫩莖為主要食用部位的一、二年生草本植物。

2、菠菜按性別分為以下幾種類型:全雌株、全雄株、雌雄同株、營養(yǎng)雄株。因此在田間生產(chǎn)的過程中去雜及其重要，在雜交種生產(chǎn)的過程中要及時去除全雄株，在授粉結(jié)束后也要及時拔掉營養(yǎng)雄株。但是由于菠菜性別分化易受外界環(huán)境因素影響存在著去雜不徹底的情況，授粉結(jié)束后營養(yǎng)雄株也存在拔除不徹底的情況，會對生產(chǎn)的雜交種純度有一定程度的影響。傳統(tǒng)種子純度鑒定一般是依據(jù)表型在田間進行，需要作物生長到一定階段對其某一個或是多個性狀進行觀測進而判斷種子純度，此方法存在周期長、工作量大、受環(huán)境因素影響大、經(jīng)驗因素影響大等缺陷。

3、pw1801菠菜是無錫普威農(nóng)業(yè)科技有限公司自主培育的的一個新品種類型，屬于扎捆型菠菜品種，葉片長偏圓形，顏色亮綠，商品性好，生長速度快，出苗后45天左右可以收獲，抗病性強，適宜河南、山東、河北、湖北、四川等地9月份露地栽培。該品種之前一直采用形態(tài)學(xué)鑒定種子純度，隨著播種面積和種子需求量的增加，急需探索出一種快捷、準確且不易受外界因素影響的純度鑒定方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的鑒定pw1801菠菜雜交種純度的ssr引物及方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中一直采用形態(tài)學(xué)鑒定種子純度導(dǎo)致的受外界環(huán)境、種植時節(jié)、種植技術(shù)和經(jīng)驗等因素影響較大并且工作量大、周期長等問題，從而在一兩個小時以內(nèi)就能夠快速準確的鑒定出pw1801菠菜雜交種的種子純度，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

3、本發(fā)明提供的鑒定pw1801菠菜雜交種純度的ssr引物，包括上游引物sp029-f和下游引物sp029-r，其中，

4、所述上游引物ssr-f為：cggaggggagaaggtttgag；

5、所述下游引物ssr-r為：accaacaatgctgattccca。

6、一種鑒定pw1801菠菜雜交種純度的方法，包括：

7、(1)提取待測樣品pw1801菠菜雜交種基因組dna；

8、(2)利用權(quán)利要求1所述引物對所述步驟(1)pw1801菠菜雜交種基因組dna進行pcr擴增；

9、(3)采用8％的聚丙烯酰胺凝膠對步驟(2)的pcr擴增產(chǎn)物進行電泳分離，進行銀染顯色；

10、(4)統(tǒng)計結(jié)果，計算pw1801菠菜雜交種純度，種子純度(％)＝(總檢測種子粒數(shù)-非雜交種數(shù)-外來雜種數(shù))/總檢測種子粒數(shù)×100％；

11、其中所述步驟(2)采用10μl的反應(yīng)體系：2×taq?master?mix?5μl，10μm的所述上游引物和所述下游引物各0.5μl，基因組dna?1.5μl，0.1μm?ph＝8.0的tris-hcl?2.5μl；

12、pcr反應(yīng)程序為：

13、第一階段：95℃預(yù)變性5min；

14、第二階段：94℃變性30s；60℃退火30s；72℃延伸1min；將此階段進行33個循環(huán)；

15、第三階段：72℃延伸7min；

16、第四階段：4℃保溫。

17、上述的鑒定pw1801菠菜雜交種純度的方法中，所述步驟(1)具體如下：取半片子葉置于2ml的離心管中；加入1顆直徑3mm的鋼珠，同時加入300μldna提取液；置于研磨機上在50hz的頻率下，研磨15s；10000轉(zhuǎn)每分鐘離心1min，取出備用。

18、上述的鑒定pw1801菠菜雜交種純度的方法中，所述步驟(3)中采用8％的聚丙烯酰胺凝膠對擴增產(chǎn)物電泳檢測；每個點樣孔加入擴增后產(chǎn)物1.5μl，電泳，待電泳指示劑距凝膠底部2cm時停止電泳；小心取出凝膠，倒入1000ml溶有1.2g?agno3的染色液中搖晃3min；將染色液倒出，加入少量蒸餾水快速漂洗，再倒入顯色液，搖晃至顯現(xiàn)出條帶為止，用蒸餾水漂洗；其中顯色液為15gnaoh、15ml甲醛定容至1000ml蒸餾水的混合液。

19、上述的鑒定pw1801菠菜雜交種純度的方法中，所述步驟(4)中計算pw1801菠菜雜交種純度，將步驟(3)得到的凝膠放置于白色燈箱上，拍照統(tǒng)計結(jié)果，比較pw1801菠菜雜交種和父母本帶型特征，表現(xiàn)為共顯性互補雙條帶的pw1801雜交種，與父母本帶型相同的為非雜交種，出現(xiàn)其他帶型的為外來雜種。

20、上述技術(shù)方案具有如下優(yōu)點或者有益效果：

21、本發(fā)明提供的一種鑒定pw1801菠菜雜交種純度的ssr引物及方法，通過篩選并使用在pw1801菠菜雜交種中能同時展現(xiàn)出父本和母本的特異性條帶、具有較強的特異性的引物，從而克服了采用形態(tài)學(xué)鑒定種子純度導(dǎo)致的受外界環(huán)境、種植時節(jié)、種植技術(shù)和經(jīng)驗等因素影響較大并且工作量大、周期長等問題，從而在一兩個小時以內(nèi)就能夠快速準確的鑒定出pw1801菠菜雜交種的種子純度，具有快速、穩(wěn)定、操作簡單、成本低廉、不受環(huán)境影響等優(yōu)點，可以高效的檢測pw1801菠菜雜交種的種子純度，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種鑒定pw1801菠菜雜交種純度的ssr引物，其特征在于，包括上游引物sp029-f和下游引物sp029-r，其中，

2.一種鑒定pw1801菠菜雜交種純度的方法，其特征在于，包括：

3.如權(quán)利要求2所述的鑒定pw1801菠菜雜交種純度的方法，其特征在于，所述步驟(1)具體如下：

4.如權(quán)利要求2所述的鑒定pw1801菠菜雜交種純度的方法，其特征在于，所述步驟(3)中采用8％的聚丙烯酰胺凝膠對擴增產(chǎn)物電泳檢測；每個點樣孔加入擴增后產(chǎn)物1.5μl，電泳，待電泳指示劑距凝膠底部2cm時停止電泳；

5.如權(quán)利要求2所述的鑒定pw1801菠菜雜交種純度的方法，其特征在于，所述步驟(4)中計算pw1801菠菜雜交種純度，將步驟(3)得到的凝膠放置于白色燈箱上，拍照統(tǒng)計結(jié)果，比較pw1801菠菜雜交種和父母本帶型特征，表現(xiàn)為共顯性互補雙條帶的pw1801雜交種，與父母本帶型相同的為非雜交種，出現(xiàn)其他帶型的為外來雜種。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供的一種鑒定pw1801菠菜雜交種純度的SSR引物及方法，通過篩選并使用在pw1801菠菜雜交種中能同時展現(xiàn)出父本和母本的特異性條帶、具有較強的特異性的引物，從而克服了采用形態(tài)學(xué)鑒定種子純度導(dǎo)致的受外界環(huán)境、種植時節(jié)、種植技術(shù)和經(jīng)驗等因素影響較大并且工作量大、周期長等問題，從而在一兩個小時以內(nèi)就能夠快速準確的鑒定出pw1801菠菜雜交種的種子純度，具有快速、穩(wěn)定、操作簡單、成本低廉、不受環(huán)境影響等優(yōu)點，可以高效的檢測pw1801菠菜雜交種的種子純度，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：宋芃垚,胡倩梅,丁郅真,孫中偉,何春霖,趙春霞,李潔,呂晨晨
受保護的技術(shù)使用者：無錫普威農(nóng)業(yè)科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/12