本發(fā)明涉及一種噻蟲啉和赭曲霉毒素a新型識別元件雙特異性抗體制備及在酶聯(lián)免疫同步檢測的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)。

背景技術(shù)：

1、農(nóng)藥殘留和真菌毒素污染是農(nóng)產(chǎn)品在生產(chǎn)、儲藏、加工和銷售過程中的重要隱患。噻蟲啉(thiacloprid，tcl)因其廣譜、高效的性質(zhì)，在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中應(yīng)用廣，殘留高。赭曲霉毒素a(ochratoxin?a，ota)作為典型真菌毒素，危害性強(qiáng)，污染范圍廣，在谷物和果蔬類農(nóng)產(chǎn)品中均有殘留。但是對于同時檢測這兩種有害物的免疫檢測方法通常采用多種單特異性抗體聯(lián)合，存在檢測成本高等缺陷。因此，基于雙特異性抗體建立這兩種污染物的同步檢測方法非常重要。

2、由于環(huán)境體系和食品供應(yīng)鏈體系之間存在著復(fù)雜的關(guān)聯(lián)性，環(huán)境中的噻蟲啉會不可避免地進(jìn)入人類食物鏈，因此食品中噻蟲啉的殘留檢測具有重要意義。目前，對于食品中tcl的檢測主要包括色譜法、質(zhì)譜法等大型儀器法和酶聯(lián)免疫檢測、熒光免疫檢測等免疫分析法。赭曲霉毒素a在食物鏈中傳播途徑頗多，因此被赭曲霉毒素a污染的食物種類繁多。為了降低人群暴露于ota的風(fēng)險，減少ota在食物鏈的傳播，越來越多的研究者致力于ota檢測技術(shù)的開發(fā)，包括儀器分析法和免疫分析法。但是，目前較為常見的快檢產(chǎn)品多為基于傳統(tǒng)免疫抗體的單一組分檢測，無法實現(xiàn)對農(nóng)藥和毒素的同時檢測，且抗體制備復(fù)雜、周期長。基于基因工程重組技術(shù)制備的雙特異性抗體識別元件很好地解決了上述問題，可以在體外快速表達(dá)，實現(xiàn)跨類有害物同步檢測。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一個目的是提供一種噻蟲啉和赭曲霉毒素a檢測抗體，其氨基酸序列如seq?id?no.6所示。

2、在一種實施方式中，所述噻蟲啉檢測抗體包含單鏈抗體和納米抗體可變區(qū)，所述單鏈的氨基酸序列如seq?id?no.4所示；所述納米抗體可變區(qū)序列如seq?id?no.5所示。

3、本發(fā)明還提供編碼所述噻蟲啉和赭曲霉毒素a檢測抗體的基因。

4、在一種實施方式中，所述基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

5、本發(fā)明還提供含有上述基因的重組載體。

6、在一種實施方式中，以pcdna3.1為表達(dá)載體。

7、本發(fā)明還提供含有上述基因或上述重組載體的細(xì)胞。

8、在一種實施方式中，所述細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞系。

9、在一種實施方式中，所述細(xì)胞為expi293f細(xì)胞。

10、本發(fā)明還提供了一種制備噻蟲啉和赭曲霉毒素a聯(lián)合抗體的方法，所述方法是將seq?id?no.3所示的核苷酸序列在expi293f細(xì)胞中表達(dá)。

11、在一種實施方式中，所述方法是以pcdna3.1為表達(dá)載體表達(dá)所述噻蟲啉和赭曲霉毒素a聯(lián)合抗體的編碼基因。

12、在一種實施方式中，所述基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

13、本發(fā)明還提供了所述噻蟲啉和赭曲霉毒素a聯(lián)合抗體在檢測噻蟲啉和赭曲霉毒素a方面的應(yīng)用。

14、本發(fā)明還提供一種聯(lián)合檢測噻蟲啉和赭曲霉毒素a的試劑盒，所述試劑盒含有所述噻蟲啉和赭曲霉毒素a聯(lián)合抗體，或所述重組載體，或所述細(xì)胞。

15、在一種實施方式中，所述試劑盒中還含有如下(a)～(c)任一：

16、(a)噻蟲啉和赭曲霉毒素a的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、所述噻蟲啉和赭曲霉毒素a檢測抗體的酶標(biāo)記物；

17、(b)噻蟲啉和赭曲霉毒素a的半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、所述噻蟲啉和赭曲霉毒素a檢測抗體的酶標(biāo)記抗體；

18、(c)所述噻蟲啉和赭曲霉毒素a檢測抗體的酶標(biāo)記物。

19、在一種實施方式中，所述試劑盒中還含有噻蟲啉和赭曲霉毒素a標(biāo)準(zhǔn)品。

20、本發(fā)明還提供所述基因，或所述重組載體，或所述細(xì)胞，或所述試劑盒在檢測噻蟲啉和赭曲霉毒素a中的應(yīng)用，所述應(yīng)用不以疾病的診斷和/或治療為目的。

21、有益效果：

22、本發(fā)明提供了一種噻蟲啉和赭曲霉毒素a的雙特異性抗體，所述雙特異性抗體由單鏈抗體和納米抗體可變區(qū)組成，所述單鏈抗體的氨基酸序列如seq?id?no.4所示，所述納米抗體可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。本發(fā)明提供的雙特異性抗體檢測噻蟲啉和赭曲霉毒素a的線性范圍分別為0.05-1000ng/ml和0.05-500ng/ml，lod分別為0.337ng/ml和0.788ng/ml，ic50分別為17.10ng/ml和16.69ng/ml。

技術(shù)特征：

1.一種聯(lián)合檢測噻蟲啉和赭曲霉毒素a的抗體，其特征在于，氨基酸序列如seq?idno.6所示。

2.編碼權(quán)利要求1所述抗體的基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

4.攜帶權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體。

5.表達(dá)權(quán)利要求1所述抗體的細(xì)胞。

6.一種制備噻蟲啉和赭曲霉毒素a聯(lián)合抗體的方法，其特征在于，以pcdna3.1為表達(dá)載體，將seq?id?no.3所示的核苷酸序列在expi293f細(xì)胞中表達(dá)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還對細(xì)胞產(chǎn)生的抗體進(jìn)行純化。

8.權(quán)利要求1所述的抗體在檢測噻蟲啉和赭曲霉毒素a中的應(yīng)用。

9.一種聯(lián)合檢測噻蟲啉和赭曲霉毒素a的試劑盒，其特征在于，含有如下(a)～(c)任一：

10.權(quán)利要求1所述的抗體，或權(quán)利要求2～3任一所述的基因，或權(quán)利要求4所述的重組載體，或權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，或權(quán)利要求9所述的試劑盒在檢測噻蟲啉和赭曲霉毒素a中的應(yīng)用，所述應(yīng)用不以疾病的診斷和/或治療為目的。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種噻蟲啉和赭曲霉毒素A新型識別元件雙特異性抗體制備及在酶聯(lián)免疫同步檢測的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種噻蟲啉和赭曲霉毒素A的雙特異性抗體，通過在Expi293F細(xì)胞中表達(dá)，并用于制備ELISA檢測試劑，可有效實現(xiàn)噻蟲啉和赭曲霉毒素A的雙特異性檢測。本發(fā)明提供的雙特異性抗體檢測噻蟲啉和赭曲霉毒素A的線性范圍分別為0.05?1000ng/mL和0.05?500ng/mL，IC50分別為17.10ng/mL和16.69ng/mL。

技術(shù)研發(fā)人員：孫秀蘭,徐嘉,孫嘉笛,紀(jì)劍,葉永麗,高松,盛利娜,張銀志
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19